类肝细胞的研究进展

龚慧宾，张全胜 综述，沈中阳，宋红丽 审校

（天津市第一中心医院器官移植中心，天津300192）

肝脏是体内最重要、最复杂的器官之一，既是机体物质代谢的核心，还具有生物转化、排泄胆汁和免疫等重要功能；肝脏同时也是一个极易受损伤的器官，代谢途径的障碍、病毒感染、毒性物质及肿瘤会导致肝脏功能的不可代偿性缺损甚至累及生命。随着肝移植的研究发展，肝细胞移植有望成为从根本上治疗肝功能衰竭的一种新方法。肝细胞的来源问题逐渐成为关注和研究的热点，干细胞分化来源的类肝细胞的研究成为解决肝细胞来源的关键点。近年来研究表明，在适宜的微环境下，骨髓干细胞、脐血干细胞均可以跨越胚层向内胚层起源的肝细胞分化，分化成具有肝细胞形态、表型和肝细胞功能特征的类肝细胞或肝样细胞（heatocyte-like cell）[1]。本文就间充质干细胞体内和体外如何分化成类肝样细胞方法及类肝细胞所具有的特点、应用前景做一综述。

1 体外实验研究

2000年11月，日本学者[2]通过骨髓细胞的体外培养，采用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)诱导，首先在体外观察了HGF对骨髓细胞向肝细胞的转分化作用。他们通过RT-PCR检测发现大鼠骨髓细胞中存在表达甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）和c-met(HGF受体)的类肝细胞，进一步检测发现这些类肝细胞还可表达细胞角蛋白CK-8和CK-18。因此他们认为，骨髓中可能包含一些表达AFP的肝脏祖细胞，这些细胞在HGF的诱导下可转化为肝细胞。Miyazkai等[3]将鼠骨髓细胞在含HGF和表皮生长因子(epdiemral growth fator,EGF)的肝细胞培养基中连续传代培养，在培养4个月内肝细胞样细胞可扩增1000倍，通过RT-PCR和免疫组化可检测出白蛋白、AFP、Thy-1和Kit等的表达。Fiegel等[4]体外培养成人骨髓干细胞发现，在28d后CD34+细胞表达白蛋白RNA和CK-19RNA，CD34+细胞显示肝特异性的基因表达，该结果提示CD34+成人骨髓细胞能在体外分化成类肝细胞。

Awiatl等[5]用HGF体外诱导培养由骨髓分离出来的b2m-/Thy21+骨髓细胞，培养后的细胞具备肝细胞表面标志物，并具备肝细胞部分功能，如能合成尿素和白蛋白。国内李文晰等[6]通过HGF、纤维细胞生长因子-4(FGF-4)体外诱导人骨髓单个核细胞向类肝细胞分化，从肝系表型和功能两方面进行检测，结果提示了类肝细胞标志物逐渐出现和成熟。杨明智等[7]将大鼠骨髓干细胞分离后分别在不同浓度HGF、EGF组合进行诱导培养，20d后通过免疫细胞化学检测到CK-8和CK-18和白蛋白，RTPCR扩增出AFP和白蛋白的mRNA。2002年，Schwartz等[8]报道，分别将正常大鼠、小鼠和人的骨髓多能成体祖细胞 (multi-potent adult progenitor cells，MAPC)接种到铺有基质明胶的培养瓶中，并加入HGF和FGF-4，培养的第7天，MAPC分化成上皮样细胞，并表达AFP、肝细胞核因子-3β(hepatocyte nuclear factor-3β，HNF-3β)、GATA4、CK19、甲状腺激素结合蛋白；第14～18天期间，表达CK-18、HNF-4，在21d后，其中25%的细胞CK18和白蛋白染色呈阳性；功能方面的检测，这些上皮样细胞具有肝细胞的功能特征：分泌尿素和白蛋白，摄取低密度脂蛋白并有储备糖原功能。结果提示体外MAPC在传了100代后仍能保持未分化状态，且经HGF和FGF-4的诱导可分化为具有形态、表型和功能特性的肝细胞。2003年，Kumoto等[9]用阴性选择磁场细胞分离系统得到丰富的骨髓间充质干细胞，分别采用共培养法和生长因子诱导法进行诱导分化，一组将骨髓干细胞与正常肝细胞培养，另一组则用20ng/mL HGF诱导培养，两组实验在3d后经RT-PCR均检测出肝细胞的特异性标记，如HNF-h和CK-18，第7天表达AFP和ALB。两组实验在不同条件培养的骨髓间充质干细胞均能检测出Notch-1受体和配体Jagged-1的基因表达。实验结果提示，Notch受体-1的表达在骨髓间充质干细胞体外分化为类肝细胞的机制中起了非常重要的作用。国内何念海等[10]用胎鼠骨髓来源的骨髓干细胞体外用乙酰唑胺（acetazolamide，AZA）预处理后培养于Matrigel包被并加用FGF-4和HGF的HGM中培养，诱导培养后的骨髓干细胞产生尿素和白蛋白，并含有糖原颗粒，不仅表达肝细胞表面标志，更有与肝细胞代谢活性一致的功能特征。2004年，Lee等[11]采用两步法诱导方案，将骨髓和脐血来源的间充质干细胞分离后，用96孔板进行单克隆扩增，并接种于含20ng/mL EGF和10ng/mL FGF的无血清培养液中培养2d，第3天加入0.61g/L烟酰胺，培养7d后改为含20ng/mL制瘤素M、1mol/L地塞米松、50mg/mL ITS+1等诱导因子的培养方法,在诱导的不同阶段，细胞表现出肝细胞功能的各种特征：（1）细胞形态的变化:第2周时细胞由原来的长梭形逐渐转变为类肝细胞的多角形。（2）细胞表型及标志物：第2周开始表达AFP、Alb、CK-18并储备肝糖原。（3）具有类肝细胞的功能：4周后具有摄取低密度脂蛋白能力、表达酪氨酸转氨酶和能诱导苯巴比妥活性的细胞色素P450。在诱导6周后开始分泌尿素，同时表达细胞核因子-4（HNF-4）。实验结果提示人类不同来源的间充质干细胞诱导分化后可成为具有肝细胞功能的肝样细胞。同年Jiang等[12]利用共培养方法，将雄性正常大鼠Fr251in-PKH+HSC与雌性CCL4肝损伤大鼠的肝组织液置于培养槽中共同培养，数小时后造血干细胞（haemopoietic stem cell，HSC）表面抗原CD45逐渐减弱；第24h后HSC表达肝转录因子(包括AFP、GATA-4、HNF-4、HNF-3β、HNF1α、C/EBPA)和成熟肝细胞标记(CK-18、、纤维蛋白原和转铁蛋白)；并利用FISH技术分析其中四倍体核型，发现只有XYXY核型，并无XXXY核型；实验结果表明，HSC参与受损肝脏修复，并排除HSC和肝细胞融合的可能。2007年，Sarah等[13]根据肝胚胎发生时的细胞因子分泌,序贯给予细胞因子FGF-4、HGF、HGF和ITS+1以及地塞米松诱导骨髓间充质细胞向类肝细胞细胞分化，实验结果提示，细胞分化为具有分泌AFP、白蛋白功能的一类细胞，并有尿素的分泌功能，PAS糖原染色阳性，表达细胞因子CK-18。加入TSA能显著增加骨髓间充质干细胞向类肝细胞分化。2008年，ZHAO等[14]采用酶学法从脐带全层组织中分离脐血间充质干细胞，采用两阶段法诱导：第一阶段培养采用补充50ng/mL HGF、10ng/mL bFGF培养体系持续14d，接下来第二阶段采用D/F12加入20ng/mL致瘤素M、1mol/L地塞米松、50mg/mL ITS+1premix培养体系持续培养14d。体外诱导脐血间充质干细胞向类肝细胞分化，诱导后14d、28d，观察细胞形态变化，免疫荧光细胞化学染色法检测AFP、白蛋白；RT-PCR检测肝细胞标志性基因AFP、ALB和CK-19mRNA。ELISA法检测诱导后的细胞培养液中白蛋白水平。流式细胞仪检测诱后细胞白细胞表面抗原HLA2-Ⅰ和HLA2-Ⅱ。实验证实从人脐带基质中分离培养的脐血间充质干细胞在向类肝细胞诱导分化培养体系的培养下,细胞形态由长梭形逐渐转化成为多角形或类圆形,并且表达AFP、ALBmRNA和白蛋白,并且诱导后的脐血间充质干细胞以时间依赖方式产生ALB，诱导后的细胞不表达HLA-DR，证实诱导分化后的类肝细胞仍具有低免疫原性。综上所述，间充质干细胞主要是在细胞因子HGF、bFGF、致瘤素M、地塞米松、ITS+1的刺激下，诱导向类肝细胞的横向分化，首先是先分化为肝前体细胞，表达肝细胞分化的早期标志GATA4、CK-19和AFP，再分化为成熟肝细胞，表达肝细胞的晚期标志HNF1-α、HNF-3β、CK-18和ALB，分化后的类肝细胞具有肝细胞的形态、表型及标志物，并具备一定肝细胞功能。

2 体内实验研究

1999年Petersen[15]报道，雄性大鼠的造血干细胞移植给雌性大鼠，1周后相继在受体非实质性和实质性肝细胞中检测到来自供体Y染色体的特异性基因。研究者将二肽肽酶阳性（DPPTV）的雄性大鼠骨髓移植给肝衰模型的雌性大鼠，同样也在受体肝细胞中检测到DPPTV的信号，提示供体造血细胞参与受体肝细胞再生。这是有关HSC分化为类肝细胞的最早报道，引发了人们的关注。Theise[16]通过相似的方法，将雄性小鼠的骨髓移植到同系雌性小鼠体内，通过ALBmRNA和Y染色体双染FISH技术发现雄性小鼠骨髓干细胞会在雌性小鼠体内分化为成熟的肝细胞。Theies[17]和Aliosn[18]还发现在人体内同样存在上述情况。Lagass等[19]在FAH缺陷大鼠模型中证实，纯化造血干细胞能在肝脏内分化为功能完备的肝细胞。国内展玉涛等[20]发现骨髓干细胞可以在大鼠肝纤维化的环境下向肝细胞分化，首先利用四氯化碳（CCL4）造成大鼠肝纤维化模型，然后用流式细胞仪分选了富含Thy+CD3-CD45-RA的骨髓干细胞，利用红色荧光燃料标记后自体移植，发现约占肝细胞总数的（0.17±0.002）%的骨髓干细胞分化成具有功能的类肝细胞。综上所述，体内间充质干细胞可以分化成功能完备的类肝细胞已经被证实，但是骨髓干细胞体内在什么微环境下，如何横向分化成类肝细胞的机制需要进一步研究。

3 肝卵圆细胞与类肝细胞的联系与区别

1994年国外学者首次在实验性肝癌诱发过程中观察到一种具有卵圆形核的胆管上皮样细胞，Forbes[21]根据其光镜下的形态特点将其命名为“卵圆细胞”。随后研究发现，在几乎所有实验性肝癌的早期均可观察到卵圆细胞不同程度的增生，并且在人慢性肝病、肝硬化的标本中也存在卵圆细胞[22]。卵圆细胞呈现为分化细胞特点，卵圆细胞也表达一系列的表面标志物，包括胆管上皮细胞角蛋白（CK-7，8，18和19）、波形蛋白（vimentin）、OV6、AFP、ALB、GGT、连接子Connexin43、细胞表面抗原HES6和BPS7，还可以表达TGF-α、γ-GFB、aFGF、IGF-Ⅱ、SCF及造血祖细胞的表面标志（Thy-1，CD34、c-kit、fit-3）等。由于卵圆细胞的异质性，上述标志物在不同的成员表达也有差异，目前较为公认的标志物有AFP、ALB、CK19和OV6。这一点和骨髓间充质干细胞诱导分化后的类肝细胞具有一定相似性，都具有相同的肝细胞表面所表达的标志物[23]。

肝卵圆细胞与类肝细胞同样都具有分化功能，卵圆细胞在特定的微环境中能活化、增殖和分化，HGF是许多细胞潜在的丝裂原，Kon等[24]研究HGF作用于OC/CDE22大鼠卵圆细胞的生物学效应和其信号传导通路，将分离的卵圆细胞培养在铺有纤维连接素的培养器皿，加入无血清的培养基进行培养，用HGF、转化生长因子-α（TGF-α）、血小板生成素（thrombopoietin）进行干预，结果显示HGF通过PI3k/AKT的激活可使卵圆细胞增殖。LJA和SIP对细胞的作用主要通过EDG受体介导。

类肝细胞和卵圆细胞都具有横向分化征象，Couri等[25]证实纯化很高的成年大鼠的肝卵圆细胞，培养在高糖环境中能横向分化形成胰腺内分泌细胞，对今后糖尿病的治疗有很大的意义。类肝细胞和卵圆细胞同时都具有促进肝细胞再生及激活肝干细胞功能，但类肝细胞如何激活肝干细胞增殖和分化的机制有待进一步研究。

4 展望

尽管近年来对间充质干细胞如何分化为类肝细胞的研究取得了很大的进步，但仍然有许多问题尚待解决：到目前为止没有十分完善的分离、培养扩增MSCs的统一标准，至今还未能筛选到MSCs特异的标记分子以及诱导分化成类肝细胞的成熟方案。具体是什么机制诱导间充质干细胞向多向分化？以及诱导后的类肝细胞和肝干细胞或卵圆细胞之间的区别和联系？这些问题都有待于进一步研究和探讨。骨髓间充质干细胞和脐血间充质干细胞的可获性、可扩增性及向类肝细胞分化性为我们展示了良好的研究和应用前景，类肝细胞所具有的肝细胞形态、表型和肝细胞的功能及其具有的低免疫原性的特点[26]，在细胞替代治疗、基因治疗[27]以及组织器官的再造中具有重要的临床应用价值。

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