长牡蛎早期胚胎发育中脂肪酸和氨基酸组成变化的研究

刘鹏超,阙华勇,张国范

(1.中国科学院 海洋研究所,山东 青岛 266071; 2.中国科学院研究生院,北京 100049)

贝类胚胎及幼虫发育过程中化学物质变化研究主要是研究贝类从受精卵到变态期间各个主要时期胚胎及幼虫体内主要生化组成(脂类、脂肪酸、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、核酸)及变化情况,国外已经开展了大量的研究[1-5],国内关于水产动物早期发育中生化组成及变化的研究主要集中在鱼类和甲壳类[6-10],贝类方面尚未见到详细报道。

长牡蛎(Crassostrea gigas)隶属于软体动物门、双壳纲、珍珠贝目、牡蛎科,是一种广温广盐性内湾贝类,其肉味鲜美,营养丰富,具有很高的经济价值,是我国主要的牡蛎养殖种类之一,也是世界各国海水养殖业重要的养殖对象。本文通过对长牡蛎早期胚胎发育中脂肪酸、氨基酸组成及变化的研究,深化对长牡蛎发育过程的了解,为长牡蛎早期发育中营养需求的研究提供基础资料。

1 材料方法

1.1 实验材料

本实验所用性成熟长牡蛎购于福建省漳州市漳浦县霞美镇,置于实验室 1立方水槽中自然海水暂养,每天换水两次,换水量为50%,定时投喂小新月菱形藻、金藻等单细胞藻类,辅以螺旋藻粉,每天投喂3次。实验时,随机选择牡蛎解剖,镜检,选择发育良好的卵子和活力好的精子实施人工授精,受精卵中一部分作为受精后0 h样品取样,其余受精卵置于50L水桶中培育,水温控制在25℃左右,每0.5 h搅拌 1次,微量充气。分别在受精后 6 h(囊胚),12 h(担轮幼虫),24 h(D形幼虫)用400目筛绢网取样。使用细胞计数板统计每毫升水样中胚胎或幼虫的数量以计算样品中总数量,所取样品经 6000 r/min离心后,小心吸去上层海水,置于-20℃下冷冻保存。

1.2 测定方法

1.2.1 脂肪酸测定方法

受精后各发育时期样品经24 h冷冻干燥处理后,参照GB/T 22223-2008的方法测定脂肪酸组成。所用仪器为Agilent 7890A气相色谱仪,每个时期样品设两个重复。

1.2.2 氨基酸测定

经24 h冷冻干燥处理的样品采用PITC(异硫氰酸苯酯)柱前衍生法测定氨基酸含量,所用仪器为alliance 2695高效液相色谱(HPLC),每个样品设两个重复。

1.3 数据分析

用单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)和Tukey’s Post Hoc Tests方法处理和比较相应的数据。所用软件为SPSS(16.0版),文中描述性统计值用平均值±标准误差表示,显著性水平设置为a=0.05。

2 结果

2.1 长牡蛎早期胚胎发育脂肪酸组成变化

长牡蛎受精后0、6、12、24 h等4个发育节点脂肪酸组成及变化情况见表1。从脂肪酸组成看,受精卵共检测到 27种脂肪酸,其中饱和脂肪酸 8种,单不饱和脂肪酸8种,多不饱和脂肪酸 11种。在8种饱和脂肪酸中,碳原子数目较少的豆蔻酸(14：0)、软脂酸(16：0)、硬脂酸(18：0)占主导地位,而奇数碳原子脂肪酸(15：0、17：0)和高碳原子数目的脂肪酸(20：0、22：0、24：0)含量较少; 在单不饱和脂肪酸中含量最高的是棕榈油酸(16：1ω7),其他的含量均较低; 11种多不饱和脂肪酸包括5种ω6系列脂肪酸和6种ω3系列 脂 肪 酸,含 量 最 高 的 是 EPA(20：5ω3)和DHA(22：6ω3),亚 油 酸 (18：2ω6)和 花 生 四 烯 酸(20：4ω6)是 ω6 中含量最高的。

饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸占总脂肪酸的比例随着发育进行不断增大,而多不饱和脂肪酸比例逐渐下降。饱和脂肪酸占总脂肪酸比例在24 h发育中上升了 18%左右; 24 h时单不饱和脂肪比例相对0 h时也有显著上升(P＜0.05),但是上升比例较小,在2%左右; 多不饱和脂肪酸比例显著下降(P＜0.05),ω3系列和 ω6系列脂肪酸比例都有不同程度的下降(表 1)。

受精后 0、6、12、24 h 4个节点∑ω3/∑ω6比值无明显变化(P＞0.05),但随着胚胎发育的进行,∑ω3与∑ω6比值呈减小的趋势。在长牡蛎24 h早期发育中,除了 20：4ω3和 DHA,其他 4种 ω3系列脂肪酸含量都显著降低(P＜0.05),而ω6系列中除20：2ω6在24 h未检出外,其他4种含量都无明显变化(P＞0.05,表1）。

DHA/EPA比值在受精后0、6、12 h三个节点无明显变化,而在受精后24 h,DHA/EPA比值有所增大,但不显著(P＞0.05)。在前三个时期DHA与EPA含量相对稳定,而在后面的发育中DHA相对EPA的含量升高(表1)。

2.2 长牡蛎早期胚胎发育中氨基酸组成变化

在长牡蛎受精后0、6、12、24 h均能检测到16种氨基酸,包括7中必需氨基酸,7种非必需氨基酸,2种半必需氨基酸,胱氨酸未检测出(表2)。

总氨基酸含量(%)干质量随着胚胎发育进行不断降低,前三个时期变化不明显,24 h时明显下降(P＜0.05)。必需氨基酸总和、非必需氨基酸总和、半必需氨基酸总和都随着胚胎发育而降低,与总氨基酸含量变化有正相关性。在受精卵中,含量最高的是谷氨酸,其次是精氨酸、赖氨酸、亮氨酸。这4种氨基酸在4个时间点含量都保持较高水平。除苯丙氨酸、苏氨酸及丝氨酸含量在发育过程个别阶段有不显著增高外,其他各种氨基酸含量都随着发育时间进行而降低(表2)。

3 讨论

3.1 脂肪酸组成及其变化

本研究中长牡蛎受精卵中饱和脂肪酸含量高于多不饱和脂肪酸,单不饱和脂肪酸含量最少。在菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)中研究发现含量最高的同样为饱和脂肪酸,多不饱和脂肪酸最少[11]。而在加拿大两种贝类虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)、巨扇贝(Crassadoma gigantea)的研究中发现,两种贝类卵子中含量最高的均为 EPA,对应的多不饱和脂肪酸含量要高于饱和脂肪酸,单不饱和脂肪酸含量最少[2,12]。不同贝类种类生殖腺或卵子中饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸比例相差很大[2,11-13],不同贝类性腺成熟过程中摄食饵料不同可能是造成这种现象的一个重要原因。此外我们发现,多不饱和脂肪酸高于饱和脂肪酸的几种贝类多为冷水性贝类或是产卵温度较低的贝类,而产卵温度较高的贝类其卵子中饱和脂肪酸含量一般较高。多不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸重要的区别是其熔点较低,可见产卵温度较低对应较低熔点的脂肪酸,而产卵温度相对高的贝类卵子中脂肪酸熔点亦较高,这可能与脂肪酸在维持细胞膜的流动性与渗透性中起重要作用相关联; 另外,多不饱和脂肪酸含量高的贝类中 EPA含量较高,而无论是哪种贝类,早期发育中 EPA都大量消耗,这说明产卵温度较低的贝类受精卵发育时可能消耗更多的 EPA,考虑 EPA在发育中的作用,这些贝类受精卵发育时可能需要更高的能量,这也与其发育时环境温度较低相对应。

在长牡蛎早期胚胎发育中饱和脂肪酸占总脂肪酸和单不饱和脂肪酸比例不断上升,而多不饱和脂肪酸比例下降,这种现象在前面提到的菲律宾蛤仔、虾夷扇贝、巨扇贝中也出现[3,12-13]。无论起始受精卵中饱和脂肪酸含量是否高于多不饱和脂肪酸,三类脂肪酸总和在这几种贝类中增高或降低趋势是相同的,只是增高或下降的程度有所不同。这可能与不同脂肪酸在胚胎发育中的功能有关,多不饱和脂肪酸比例下降主要是EPA含量下降,而EPA在胚胎发育中作为能源消耗,这可能是导致三类脂肪酸比例变化的一个重要原因。

表1 长牡蛎受精后不同时间脂肪酸组成(% 总脂肪酸)变化Tab.1 Variations of fatty acids (% Total fatty acids) of Pacific oyster (Crassostrea gigas) at different times postfertilization

长牡蛎从受精卵发育到 D形幼虫,∑ω3与∑ω6比值呈减小的趋势,ω3系列中部分脂肪酸相对于ω6系列脂肪酸更快的消耗。Pernet等[14]研究发现在深海扇贝(Placopecten magellanicus)随着幼虫发育其∑ω6与∑ω3比值会增大,认为贝类幼虫会选择性地整合或保持 ω6系列脂肪酸,而 ω3系列脂肪酸会被选择性地消耗利用。而在珍珠贝(Pinctada margaritifera)产出的卵子中∑ω3与∑ω6比值显著小于生殖腺中卵子各发育时期[15],∑ω3与∑ω6比值的这种变化可能从卵母细胞发育就开始,具有一定的连续性。

表2 长牡蛎受精后不同时间氨基酸组成(% 干质量)Tab.2 Amino acid composition of Pacific oyster (Crassostrea gigas)at different times post-fertilization.

长牡蛎早期胚胎发育中 DHA/EPA比值不断变化,总体上呈上升趋势。虽然DHA和EPA含量都在下降,但是EPA消耗更迅速一些。在以前的研究中,很多学者就发现 EPA和DHA在双壳贝类发育中有非常重要的作用,大多数双壳贝类自身不能合成EPA和DHA。在早期发育中EPA更多的作为能源消耗,而 DHA主要作为一种结构物质,起构建作用。在 Whyte等[3]对巨扇贝的研究中,在 72 h发育中DHA含量基本无变化,这与本实验结果有一定差别,但是两项实验结果中 EPA含量都明显降低,都表明DHA相对EPA含量升高。

3.2 氨基酸的含量变化

氨基酸总含量(%干质量)呈下降趋势,到受精后24 h的D形幼虫时期显著降低,但是仍然保持较高水平(占干质量的22%左右)。在所检测的必需氨基酸中,赖氨酸Lys与亮氨酸Leu含量最高,并且在受精后四个时间都保持较高的含量。生物体的代谢中,Leu可分解成乙酰COA和乙酰乙酸,而两者均是沟通糖类与脂类代谢的重要中间物质。在非必需氨基酸中谷氨酸Glu含量最高,可能有两方面的原因,一是海水贝类为排氨动物,早期胚胎或幼虫代谢产生的氨需与 Glu结合形成相应的谷氨酰胺,经酶分解成游离的氨排出体外; 另外谷氨酸在酶的催化下,可生成相应的α—酮戊二酸,而α—酮戊二酸又是三梭酸循环中关键的中间代谢产物,在胚胎发育时期谷氨酸对糖、脂、蛋白质的代谢及相互转化有重要意义。

致谢：特别感谢福建省水产研究所曾志南、宁岳老师在长牡蛎亲贝材料方面的支持,感谢实验室杜润山老师、刘磊同学在幼虫培育中对我的指导和帮助。

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