木糖发酵产乙醇丝状真菌的鉴定及发酵特性

范金霞，杨 谦，姚 琳，陈 刚

(哈尔滨工业大学生命科学与工程系，150001哈尔滨，yangq@hit.edu.cn)

燃料乙醇因其污染小、具有环境友好型的特点，成为新型燃料资源有望取代日益减少的化石能源(如石油和煤炭)［1］.传统乙醇发酵原料为玉米、淀粉等粮食作物，粮食短缺的今天这一生产方式受到很大的限制.木质纤维素物质(如农作物废弃物、木屑、薯渣等)是世界上最为丰富的生物质资源［2］，由纤维素、半纤维素和木质素组成，其水解产物主要是葡萄糖和木糖.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)能发酵葡萄糖但不能发酵木糖产生乙醇.80年代以来，众多的学者进行了木糖菌种的筛选以及菌种遗传工程改造研究，木糖发酵微生物主要集中在毕氏酵母(Pichia)，假丝酵母(Candida)和管囊酵母(Pachyso1en)3个属［3］，构建基因重组菌常用的宿主菌种有酿酒酵母(S.cerevisiae)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)和大肠杆菌(E. coli)［4-6］，对丝状真菌的木糖发酵研究的很少.本试验从自然界中筛选到一株丝状真菌发酵木糖产乙醇的菌株，对其进行了形态学和分子生物学鉴定，同时对其发酵特性进行了研究.

1 试验

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌种

cs-28由本试验室分离，现已送至中国典型微生物研究所保存.E.coli Top10为本实验室保存.树干毕赤酵母(Pichia stipitis)来自中科院微生物研究所.

1.1.2 试剂

Taq DNA聚合酶、dNTP、pMD-18T载体、DNAMarker(DL2000)购自宝生物工程(大连)有限公司;胶回收试剂盒购自上海华舜生物公司，引物合成和测序由上海生工生物技术有限公司完成;木糖购自美国Sigma公司;其他试剂均为国产分析纯试剂.

1.1.3 培养基

初筛培养基(PXA):马铃薯200 g·L-1，木糖20 g·L-1，琼脂20 g·L-1，pH值自然.

复筛培养基:木糖2%，酵母粉0.4%，蛋白胨0.2%，(NH4)2SO40.6%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2‰，CaCl20.1‰.

发酵培养基:KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.2‰，CaCl20.1‰，碳源2%，氮源1.2%.

种子培养基(PX培养基):马铃薯200 g· L-1，木糖20 g·L-1，pH值自然.

PDA培养基:马铃薯200 g·L-1，葡萄糖20 g ·L-1，琼脂20 g·L-1.

1.2 试验方法

1.2.1 菌种分离，纯化和筛选

取1 g采集的土样溶于10 mL无菌水中30℃振荡1 h，经适当稀释后，涂布于PXA平板上，30℃恒温培养48 h;挑取生长较快菌落，经多次分离纯化，将获得的丝状真菌纯培养物保存.纯化后的单菌落经复筛培养基进行杜氏管发酵试验进一步筛选，最后利用发酵培养基进行乙醇质量浓度的测定，挑选出乙醇产量最高的菌株作为下一步研究对象.

1.2.2 菌种鉴定

形态学鉴定参考文献［7］.分子生物学鉴定根据18S rRNA ITS序列引物:T1:5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'，T2:5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'.基因组DNA提取参见文献［8］方法进行.PCR反应体系:所有PCR反应均在20 μL标准反应体系中进行，其中含2 μL Buffer缓冲液，1.6 μL 2.5 mmol/L dNTPs，每一引物均1 μL(10 mmol/L)，0.125 μL Taq酶，1 μL模板DNA，加无菌超纯水至20 μL，于PCR仪上按94℃预变性5 min，然后按94℃、30 s，56℃、30 s，72℃、1 min，循环32次，最后72℃延伸10 min.PCR产物的克隆测序:按照胶回收试剂盒说明回收目的片段，连接克隆载体，转化大肠杆菌感受态细胞Top10，提取质粒DNA，双酶切鉴定后，挑取阳性克隆子送至上海生工生物技术有限公司进行测序.测序结果利用NCBI网站的Blastn和DNASTAR进行序列比较分析.

1.3 分析方法

乙醇产量测定采用重铬酸钾比色法［9］.木糖质量浓度测定采用DNS比色法［10］.

1.4 发酵特性研究

1)不同碳源对乙醇产量的影响.选取12种不同的碳源，按质量比2%加入到发酵培养基中.

2)不同氮源对乙醇产量的影响.选择12种不同的氮源，按质量比1.2%加入到培养基中，以2%的木糖作为碳源，获得最佳氮源.

3)初始pH值对乙醇产量的影响.用盐酸调节发酵培养基的初始pH值，分别为5.0、5.2、5.4、5.8、6.0、6.2，确定最佳的发酵酸碱条件.

4)不同温度对乙醇产量的影响.将接种后的液体培养基分别放在20、24、26、28、30、32、34、36℃的培养箱中静止培养，比较温度对产乙醇的影响.

5)不同初始木糖质量浓度对乙醇产量的影响:在发酵培养基中加入质量比分别为2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的木糖进行发酵，比较乙醇产量.

2 结果与分析

2.1 菌种的分离，筛选和鉴定

2.1.1 菌种的分离与筛选

通过对30份土样中筛选得到能在PXA培养基上生长的菌株58株，利用杜氏管发酵检测到16种菌株能产气，对其进行发酵试验，测定乙醇产量，得到一株产乙醇量最高的菌株cs-28.通过cs-28与树干毕赤酵母乙醇产量的比较可以看出，cs-28最高乙醇产量在发酵的第144小时，而树干毕赤酵母在第96小时，cs-28产乙醇的周期比树干毕赤酵母长，但乙醇产量高于毕赤酵母(图1).

图1 cs－28与树干毕赤酵母乙醇产量的比较

2.1.2 形态学鉴定

将cs-28放在PDA培养基上培养.该菌株在培养2 d后菌落直径超过2.5 cm，7 d达8～9 cm;在室温(25℃)下，菌丝生长良好，棉絮状至绒毛状，最初白色，逐渐中央粉色，后期转变为紫色，培养基反面深紫色(图2).菌丝经棉兰染色后显微镜观察结果:菌丝有隔，分枝，透明;有大小两种类型分生孢子(图3(a))，小型分生孢子数量较多，从菌丝的侧生而单出的瓶状小梗上长出或从分生孢子梗上长出，不呈链生而是假头状着生，椭圆形、纺锤形、卵形、逗点形;大型分生孢子时常较少，产于粘孢团中或从分孢子梗上长出;镰刀形、纺锤形;顶端细胞窄细;有隔，3～6个分隔(图3(b)).

图2 cs－28在PDA培养基中生长7 d的菌落形态

图3 cs－28孢子的显微观察

2.1.3 分子生物学鉴定

以cs-28基因组DNA为模板，应用真菌通用的18s rRNA引物进行PCR扩增，得到大约500 bp片段(图4)，将目的片段连接克隆载体pMD-18T后进行测序.利用DNASTAR软件队测序结果进行处理后，获得了535 bp核苷酸序列.通过NCBI网站上Blastn(http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)进行相似性搜索，结果显示与Fusarium oxysporum的相似性为100%，结合形态学观察结果可以确定该菌株为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum).

图4 cs－28 18s rRNA片段扩增结果

2.2 发酵特性

2.2.1 不同碳源对乙醇发酵的影响

选取12种不同的碳源进行发酵试验，结果见图5，cs-28对蔗糖、葡萄糖发酵产乙醇能力最强，对乳糖的发酵能力最弱.对12种碳源均有不同程度的乙醇发酵能力，其碳源应用谱广泛，有望成为工业发酵待选菌种.

图5 不同碳源对cs－28乙醇产量的影响

2.2.2 不同氮源对乙醇发酵的影响

不同氮源对cs-28发酵产乙醇的试验结果见图6.可以看出，有机氮源比无机氮源产乙醇的量高.在有机氮源中yeast extract的产乙醇量最高，达4.28 g·L-1，与黄豆面发酵效果持平，考虑到发酵成本，以下的发酵试验中采用黄豆面作为氮源.在无机氮源中，硝态氮比铵态氮效果好.其中NaNO3的发酵效率最高，达2.61 g·L-1.

图6 不同氮源对cs－28乙醇产量的影响

2.2.3 不同温度对乙醇发酵的影响

温度对乙醇发酵的影响很大，温度过高会增加乙醇的蒸发，温度过低影响菌体生长，从而影响乙醇产量.试验结果(图7)表明:随着温度的升高，乙醇产量逐渐升高，温度为30℃时乙醇产量最高，随后逐渐下降.

图7 不同温度对cs－28乙醇产量的影响

2.2.4 初始pH值对乙醇发酵的影响

初始pH值分别设为5.4、5.6、5.8、6.0、6.2，随着pH值的升高乙醇产量呈上升趋势，pH为6.0时乙醇产量最高，为5.51 g·L-1，随后又急剧下降(图8).

图8 不同pH对cs－28乙醇产量的影响

2.2.5 初始木糖质量浓度对乙醇发酵的影响

初始木糖质量浓度对乙醇产量的影响极大，随着木糖质量浓度的增加，乙醇产量也逐渐增加，但是乙醇产率却逐渐下降(图9)，初始木糖质量浓度为20 g·L-1，乙醇产率最高，即木糖转化率最高.

图9 初始木糖质量浓度对cs－28乙醇产量的影响

3 讨论

本试验筛选到的发酵木糖产乙醇的菌种为尖孢镰刀菌，据文献［11-12］报道，尖孢镰刀菌不仅能产生多种纤维素酶系和半纤维素酶系，同时还具有降解多环芳烃蒽和苯酚的能力［13-14］，这为环境固体废弃物和多环芳烃物质的降解提供了优良菌种.Panagiotou G等［15］利用尖刀镰刀菌F3实现纤维素的同时糖化和发酵.尖孢镰刀菌利用硝态氮的能力优于铵态氮，这与Naim M S等［16］研究的结果一致.同样是丝状真菌，最适的发酵初始pH值不近相同，虽然都在微酸性条件下，尖孢镰刀菌最适pH为6.0，而粗糙脉孢霉的最适pH为5.0［17］.不同菌种对糖质量浓度的适应能力不一样，酿酒酵母在高糖溶液(300 g·L-1)中仍然可以进行发酵，而尖孢镰刀菌的最适木糖质量浓度(20 g·L-1)，比Pachysolen tannophilus的最适木糖质量浓度［18］低，这可能与细胞膜透性和渗透压有关［19］.

4 结论

1)筛选到一株发酵木糖产乙醇的菌种cs-28，经过形态学和生物学鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum).

2)最适的发酵条件温度为30℃;pH值为6.0;最适有机碳源为酵母提取物，无机碳源为NaNO3.

3)尖孢镰刀菌(F.oxysporum)具有发酵多种碳源的特性，为秸秆的资源化利用和能源的生产提供了新的菌种资源.

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