不同预处理方法对剩余污泥厌氧发酵产氢的影响

李建政，昌 盛，刘 枫

(哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室，150090哈尔滨，ljz6677@163.com)

发酵法生物制氢，能以可再生的生物质，甚至是富含生物质的废水、垃圾或禽畜排泄物为原料［1-5］，在清洁能源生产、废物资源化和环境保护等方面均显示出重要意义，展现出较好的发展前景［3，6-7］.以混合菌群(活性污泥)为基础的发酵法生物制氢技术，其基本原理是产酸发酵细菌将有机物分解为有机酸(乙酸、丁酸)和乙醇等产物的同时，释放H2和CO2［7］.大量研究表明，生物发酵制氢的种泥来源十分丰富，农田土壤、城市污水处理厂的好氧污泥和消化污泥、市政排水管网下水道的底泥以及厌氧生物处理反应器中的污泥均可作为产氢菌种来启动制氢反应器［8］.然而，这些污泥中的微生物种类繁多，常有耗氢菌的存在，如产甲烷菌和同型产乙酸菌等，它们的耗氢行为，不可避免地会降低发酵系统的产氢效能和延长反应器的启动时间［9-13］.为了最大程度地提高接种污泥中产氢菌的数量和活性，将耗氢菌的数量降到最低，缩短反应器启动周期，国内外研究中对接种至生物制氢反应器的污泥采用了多种方法进行预处理，但由于选用的种泥以及具体的处理条件不同，得出的结论各异，有的研究认为热处理最为合适［14-15］，有的认为酸处理最为有效［16-17］，对各种预处理方法进行全面对比分析的报道还较少［15］.本文以最易获得的城市污水处理厂好氧活性污泥为对象，通过间歇发酵试验，对比分析了种泥经酸、碱、热、曝气、氯仿——CHCl3和二溴乙烷磺酸钠——BES等6种预处理方法处理后的产氢性能和发酵特性，以筛选出最为合适有效的预处理方法，寻求产氢菌的富集方法，为连续流生物制氢反应器的快速启动以及提高系统的产氢效能提供指导.

1 试验

1.1 种泥来源与预处理方法

试验采用的种泥取自哈尔滨市太平污水处理厂二沉池排放的剩余污泥，取得污泥后，经淘洗过滤，去除污泥中的大颗粒物，沉淀0.5 h，去上清液后使用，其 MLSS、MLVSS分别为 20.35和14.43 g/L.取混匀污泥50 mL 8份，分别置于7个100 mL的烧杯中，按以下顺序进行各种预处理:①酸处理:用4 mol/L的HCl将污泥pH值调节为3，在搅拌下维持pH值稳定5 min后，静置24 h;②碱处理:用6 mol/L的NaOH将污泥pH值调节为10，在搅拌下维持pH值稳定5 min后，静置24 h;③热处理:在100℃的水浴锅中恒温加热处理30 min;④曝气处理:以500 mg/L的质量浓度加入葡萄糖，曝气培养24 h;⑤CHCl3处理:以0.1%的体积分数加入CHCl3溶液，磁力搅拌机下搅拌1 h后，静置24 h;⑥BES处理:以10 mmol/L的浓度加入一定质量的BES，磁力搅拌机下搅拌1 h后，静置24 h;⑦第7个烧杯中未经过预处理的污泥作为空白对照.

1.2 培养方法

间歇发酵反应器采用容积为296 mL的血清瓶.装瓶方法为:每只灭菌血清瓶移入85 mL培养液后，用无菌注射器以15 mL的剂量接种经不同方法预处理过的污泥或未经处理的对照污泥(反应体系中的污泥浓度(MLVSS)约为2 g/L)，并用1 mol/L的NaOH和HCl溶液将混合液的初始pH调为7.0;充高纯氮气5 min，胶塞密封.接种完成后的反应体系，总体积为100 mL，营养组分如下(g/L):C6H12O6·6H2O 10.0;NH4C1 0.5; KH2PO40.5;K2HPO40.5;NaHCO34.0;MgC12· 6H2O 0.2;ZnSO4·7H2O 0.01;MnC12·4H2O 0.03;H3BO30.03;CoC12·6H2O 0.02;CaCl2· 2H2O 0.01;NiCl2·6H2O 0.02;Na2MoO4·2H2O 0.03;FeC12·4H2O 0.15.将密封后的血清瓶置于恒温空气浴振荡器中，在150 r/min下35℃恒温培养30 h.对照污泥和各预处理后的污泥样品的培养，均采用3只培养瓶平行进行，相关分析数据取3个平行反应系统平均值.

1.3 分析方法

pH、MLSS和MLVSS采用国家标准方法测定［18］，葡萄糖测定采用DNS法［19］.发酵产气量采用10～100 mL的玻璃注射器定时排气计量，并折算为标准状态(0℃，101.325 kPa)体积数;发酵气组分采用气相色谱仪进行分析［20］，累积产氢量参照Owen法进行计量［21］.以无菌注射器定时从反应瓶中抽取反应液1.5 mL，6 000 r/min离心，取上清液0.5 mL 2份，分别用于葡萄糖质量浓度和液相末端发酵产物(VFAs和乙醇)的分析.其中，VFAs和乙醇的分析采用另一台气相色谱仪测定［20］.

2 结果与讨论

2.1 产氢量

在42 h的发酵反应过程中，对照样品及其他经过预处理的污泥样品的反应体系中，所产生的生物气中只含有H2和CO2，均未检出CH4.然而，在Hu和Chen的研究中，未经处理的污泥在降解糖类发酵产氢时，有CH4存在，造成这种差异原因可能是本文的接种污泥来源于城市污水处理厂的二沉池，污泥中的微生物以好氧和兼性菌种为主，仅含有少量甲烷甚至不含有产甲烷菌种，所以，本文的研究中，未经处理的污泥进行发酵产氢时，未检测到CH4.图1显示了不同预处理方法对累积产氢量的影响，在发酵反应进行到24 h时，各发酵体系的累积产氢量达到最大值，分别为31.81(对照)、169.95(酸)、144.43(碱)、100.25 (热)、72.98(曝 气)、51.24(CHCl3)、28.32(BES)mL.发酵产氢反应进行到24 h之后，各发酵体系的累积产氢量都有一定量的下降，但并未检出CH4.这一现象说明，系统中存在着除甲烷以外的其他耗氢菌群，这与Bita和Yu等所报道的结果相似［14，22］.

图1 不同预处理方法下的累积氢气产量

式中:H为累计产氢量(mL)，Pmax为最大产氢量(mL);Rmax为最大产氢速率(mL/h)，λ为延滞时间(h).

利用Origin 8.0软件进行拟合的结果见表1，改进的Gompertz模型比较适合于描述反应过程中累积产氢量的变化，复相关系数 R2均大于0.99.除了经过BES预处理的污泥样品外，其他经过预处理后的污泥样品对葡萄糖进行发酵获得的最大产氢量(Pmax)和最大产氢速率(Rmax)都远大于未处理的污泥.据文献报道［15，17］，对糖类进行厌氧发酵能代谢产氢的微生物主要以梭菌属为了解发酵系统产氢的动力学特征，采用改进的Gompertz模型(式(1))对得到的累积产氢曲线进行了非线性拟合［23］:高和肠细菌为主，由于梭菌属在极端环境下，如温、强酸、强碱和化学药物抑制剂下，能形成芽孢，具有自我保护功能.还有研究表明［15］，大部分梭菌属和肠细菌能在少量氧气存在下存活.而产甲烷和同型产乙酸菌等则属于严格的厌氧菌属，当有氧气存在时将失去活性.于是，当污泥经过预处理后，相对于产甲烷和同型产乙酸菌种来讲，梭菌属和肠细菌仍得以存活下来的几率要更大.因此，对污泥采用合适的预处理方法，在抑制产甲烷和同型产乙酸等耗氢菌群的同时，保持了产氢菌的活性，提高了发酵系统的最大产氢量和最大产氢速率.同时，对接种污泥采用不合适的预处理方法，有可能抑制住产氢菌的活性，而减小产氢效能［17，24］.在本文采用的预处理方法中，经过BES处理的污泥，其Pmax和Rmax较对照的污泥样品要小，而采用酸预处理后的效果最好，其Pmax和Rmax分别为171.14 mL和22.26 mL/h，碱处理次之，Pmax和Rmax分别为145.73 mL和20.73 mL/h，这与Lin等［16］的研究结果一致，而Wang等［15］的研究表明，采用热处理的方法，获得的效果最好，这可能是由于种泥不同所致.

表1 不同预处理方法下的发酵产氢动力学参数

在各发酵体系反应的初期，由于接种污泥对新环境的调整适应，均表现出一个或长或短的延滞期.其中，经CHCl3和BES处理过的污泥延滞时间(λ)较大，分别为9.37和7.85 h，这可能是由于药剂的毒性作用所致;而经曝气、热处理的污泥，其延滞期较短，分别为3.69和5.66 h;经酸、碱处理的污泥，λ为6.8 h左右，与空白相当.这进一步表明，采用污泥预处理的方法能有效富集产氢菌种，促进厌氧活性污泥的产氢活性，并且不同的预处理方法对原始种泥的菌种选择作用不同，获得的效果也存在差异.

2.2 液相末端发酵产物

表2总结了对照及各种污泥样品发酵体系在第42小时时发酵产物各成分的浓度.由发酵产物组成分析可知，污泥样品的预处理对其产酸发酵特征有直接影响.由于接种污泥为二沉池的剩余污泥，从污水处理厂取回即用，属于好氧污泥，污泥中好氧微生物居多，所以，未经处理的污泥，和经曝气、BES处理后的发酵反应体系，发酵产物均主要以乙醇和乙酸为主，其中，经曝气预处理后，乙醇和乙酸摩尔分数分别为50.3%、47.0%(表2)，属典型的乙醇型发酵［8，25］，Ren等［25］也得到了相同的结果.经过热、CHCl3预处理的污泥，其代谢产物主要以乙醇、乙酸和丁酸为主，其摩尔分数均在30%～40%，属于混合酸发酵［8］.而经过酸、碱预处理的污泥，其利用葡萄糖发酵进行产氢的产物主要以丁酸和乙酸为主，摩尔分数分别为40.2%、30.8%和44.9%、37.9%，表明酸、碱处理有利于丁酸梭菌属产氢发酵菌群的富集，这与Yu和Lin等的研究结果一致［14，16］.以上结果表明，不同预处理对种泥原有微生物群落结构的改变存在差异，这可能是导致在相同的培养条件下，各反应体系表现出不同产酸发酵特征的主要原因，Guo等［25］的研究对这一观点已经提出了有力的证据.

表2 预处理对液相末端发酵产物的影响mmol·L-1

由表2可以看出，经过曝气处理的污泥，其发酵产物中的丁酸浓度最小，仅为0.25 mmol/L，表明曝气对丁酸梭菌属的抑制作用较强，所以，在Guo和Ren等的研究中［8，25］，对污泥采用曝气预处理，均能较快地实现间歇、连续流的乙醇型发酵，而对污泥采用酸、碱预处理后能形成丁酸型发酵［8，14］.同时，Li等［26］的研究表明，乙醇型发酵较丁酸型发酵其氢气产率要更高，更利于产氢.然而，在本实验中，采用曝气预处理形成的乙醇型发酵，获得的产氢量较采用酸处理形成的丁酸型发酵类型时的要小(表1)，分析认为，这可能是由于种泥中存在同型产乙酸菌所致.在文献［8，25-26］中，曝气预处理的时间一般在1周左右，而本文的曝气处理仅为24 h，所以，短时间的曝气难以有效抑制同型产乙酸菌种，而引起了代谢产物中乙酸摩尔分数较大，占到总挥发酸产物的47.0% (表2)，而经酸处理的发酵体系，乙酸摩尔分数仅占30.8%(表2)，这表明经24 h曝气处理后的污泥，虽然显著地激活了发酵产氢产乙醇菌种，但对可利用H2和CO2合成乙酸的同型产乙酸菌无明显抑制作用.如图1所示，第24小时后的氢气体积下降，以及无CH4气体检出，也间接证明了系统中存在着同型产乙酸菌种.而同型产乙酸菌在发酵制氢系统中的作用，目前，已经成为了一个热门的研究课题，在Hallenbeck和Bita等［7，9］的研究中均有报道，其作用机制和经济有效的控制技术还有待深入研究.

2.3 葡萄糖的降解

未经热处理的和经热处理过的各污泥样品，在发酵产氢过程中，对葡萄糖的降解情况存在显著差异，经预处理的污泥，葡萄糖的降解率均大于未经处理的发酵反应体系.如图2所示，经过酸、碱、热处理的污泥，其葡萄糖的降解率均达到了90%以上，其中经热处理的降解率最大，为91.6%.经CHCl3和BES处理的污泥，其葡萄糖的降解率为70%左右，经曝气预处理获得的葡萄糖降解率则为77.5%.以上结果表明，经过酸、碱处理的污泥，在能获得最大产氢量和最大产氢速率的同时，还能获得较高的底物降解率.因此，对于利用有机废水进行发酵产氢来讲，以经酸或碱预处理的好氧污泥作为接种污泥是较好的选择.

图2 不同预处理方法下葡萄糖的降解

2.4 生物量和pH

各发酵体系在反应42 h后，其生物量都有大幅增长(图3)，分别从起始的2 g/L左右提高到了7.57(对照)、4.85(酸)、5.02(碱)、5.30(热)、6.6(曝气)、7.30(CHCl3)、8.58(BES)g/L.这一生物量增幅显著高于现有文献报道的水平［15-16］.由于酸性末端产物的积累(图3)，各反应体系的pH也分别从初始的7降低到了3.83(对照)、4.35(酸)、4.54(碱)、3.88(热)、3.95(曝气)、3.93(CHCl3)、3.91(BES).当pH小于4.0时，会严重抑制活性污泥微生物的代谢活性［8］，这可能是导致对照、曝气、氯仿、BES预处理污泥对葡萄糖的降解率较低的原因(图2).

2.5 预处理剩余污泥对发酵产氢活性的影响

污泥经其他方法预处理后，被灭活的微生物残体与芽孢和具有活性的菌体一同被保留在污泥样品中，是发酵系统中生物量(MLVSS)的组成部分.为此，以新增生物量的比产氢率为指标，比较分析了不同发酵系统微生物群落的代谢活性.由于加入BES对好氧污泥微生物的选择作用较小，未经预处理和经BES预处理的污泥样品，保留了原有的所有微生物类群.由于菌体数量基数大，经42 h发酵后，其新增生物量MLVSS显著高于其他预处理后的发酵体系，未经预处理和经BES预处理的生物产量分别高达0.83和0.96 g(表3).经酸、碱、热、曝气、CHCl3预处理的各污泥样品发酵体系，其新增的生物量分别为0.31，0.35，0.37，0.56，0.78 g，其新增生物量的比产氢率分别为27.29，21.69，13.84，7.14，4.43 mol/kg，分别是未经热处理污泥样品的10.45，8.31，5.30，2.74，1.70倍.从表3还可以看出，葡萄糖的氢气转化率与生物量的增长量呈现负相关的关系，新增的生长量越大，获得的产氢转化率越小，经酸、碱预处理后的发酵系统，生物增长量最小，其单位基质葡萄糖的氢气转化率分别达1.51和1.34 mol/ mol，显著高于其他的发酵系统.以上分析表明，对好氧活性污泥采用适当的预处理，可显著提高发酵产氢菌群的活性.

图3 不同预处理条件下终止pH和生物量

表3 不同预处理方法对活性污泥发酵产氢特性的影响

3 结论

1)城市污水处理厂的好氧活性污泥采用合适方法的预处理，可以显著提高其厌氧发酵产氢活性.采用酸、碱、热、曝气、CHCl3均能有效提高种泥的发酵产氢活性，而采用BES的预处理不利于产氢.

2)各种预处理方法获得的产氢效能由大到小依次为酸＞碱＞热＞曝气＞CHCl3＞BES，经酸和碱处理的种泥样品表现出良好的产氢效能，其葡萄糖的氢气转化率分别达到 1.51和1.34 mol/mol，污泥的比产氢率分别为27.29和21.69 mmol/g，而未经处理的污泥，其葡萄糖的氢气转化率和污泥的比产氢率仅分别为0.38 mol/ mol和2.61 mmol/g.

3)不同的预处理方法可导致种泥微生物群落结构的差异，在发酵葡萄糖时表现出不同的代谢特征.其中，经酸、碱预处理的发酵体系表现为丁酸型发酵;经曝气、BES预处理的发酵体系表现为乙醇型发酵;经热、CHCl3预处理的发酵体系呈现为混合酸发酵特征.

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