甘孜州牦牛沙门氏菌的分离和鉴定

董映辉，张朝辉，毛全富，岳 华，余 劲，李 劲

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.四川省甘孜州动物疫病预防控制中心，四川 康定 626000；3.四川省炉霍县动物疫病预防控制中心，四川 炉霍 626500）

2010年6月，四川省甘孜州炉霍县12户牧民的100多头成年牦牛发病，根据流行病学情况、临床症状、病理解剖学变化情况初步诊断为沙门氏菌病，随即进行实验室鉴定，现将诊断情况报告如下：

1 概况与诊断方法

1.1 发病情况 四川省甘孜州炉霍县12户牧民的1 300头成年牦牛，2010年5月11日开始发病，发病一周左右出现死亡，平均每天死亡1～2头，截至6月2日送检，发病100余头，死亡30余头。发病牦牛精神沉郁，食欲废绝，跪卧，呼吸困难，体温升高至41.5℃，有轻微神经症状，鼻腔有脓性分泌物，便秘后腹泻，粪中带有肠黏膜和血。随病程发展病牛消瘦，眼窝下陷，皮肤弹性降低，后期卧地不起，四肢末梢发凉，一周后衰竭而死。

1.2 剖解变化 发病牦牛主要的剖解变化为心包积液；肝脾脏肿大；肺脏水肿出血；真胃出血，胃内有未消化的白色凝乳块；肾结石，表面有出血点；小肠黏膜脱落，有出血点；大肠出血等。

1.3 实验室检验

1.3.1 病料涂片镜检 采取病死牦牛的心、血、肝脏和脾脏触片，瑞氏染色，镜检。

1.3.2 细菌的分离培养 无菌采取病死牦牛的心脏、肝、脾、肾脏，接种在营养丰富的TSA琼脂平板培养基中，经37℃培养24h，革兰氏染色，显微镜观察。

1.3.3 鉴别培养 采上述组织器官病料培养的典型菌落，接种在SS培养基中，经37℃培养24h后观察。再将SS培养基中长出的典型菌落接种到伊红、美兰、血液琼脂培养基和肉汤培养基中，经37℃培养24 h后观察。

1.3.4 生化实验 从TSA琼脂平板培养基中挑选出具有代表性的菌落10株（编号为S1～S10），分别接种于微量发酵管中，置于37℃温箱中培养2～3d，每天观察反应情况。

1.3.5 血清学鉴定 采用玻片凝集法进行血清型鉴定。在玻片上用少量生理盐水稀释普通营养琼脂平板上的纯化菌落，用微量加样器吸取沙门氏菌A-F多价标准诊断血清与之混合均匀，然后观察。

1.3.6 16SrRNA的扩增、测序及系统发育分析 将分离得到的细菌接种于普通营养肉汤中，于37℃振荡培养24h，取培养液按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明提取细菌基因组DNA，用Peter等设计的针对革兰氏阴性菌16SrRNA基因引物进行16SrRNA扩增，引物信息见表1。扩增片段经胶回收试剂盒纯化后与PMD18-T载体连接，转化DH5α工程菌进行目的片段克隆，经酶切鉴定，菌液PCR鉴定为阳性克隆后再送大连宝生物公司测序。

1.3.7 动物实验 将纯化的分离菌接种于普通营养肉汤，置37℃摇床培养18h。菌液用比浊法记数，将菌液稀释至5×108cfu/mL，腹腔注射小鼠5只，每只0.2mL，对照组5只小鼠腹腔注射灭菌普通肉汤（0.2mL/只）。接毒后的小鼠隔离饲养，观察其发病及死亡情况。死亡的小鼠立即剖检，无菌采取肺脏、肝脏、心血涂片、革兰氏染色、镜检，并在营养琼脂平板上划线分离培养，同时观察病理学变化。

2 结果

2.1 病料触片观察结果 病料触片经瑞氏染色，可从镜检中观察到无芽孢、无荚膜，两极淡染的中等大小杆菌。

2.2 细菌分离、鉴别培养的结果 在营养丰富的TSA培养基上37℃培养18h便长出了明显的菌落，经观察沿接种线处生长出圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、灰白色、半透明的中等大小菌落，不同器官中分离到的菌落形态基本一致，各器官分离到的典型菌落经革兰氏染色镜检，结果均为革兰氏阴性小杆菌，与直接涂片的菌体形态相同。在SS鉴别培养基中，经37℃ 24h培养观察，生长出半透明、灰白色、呈圆珠状、能溶解胆盐并有光泽的小菌落；菌落的边缘色泽浅，中心色泽深，并稍突起。在伊红、美兰、血液琼脂培养基和肉汤培养基中，经37℃ 24h培养观察，伊红、美兰培养基上的菌落呈露珠状、粉红色、边缘整齐；血液琼脂平板上的菌落为灰色圆珠状，边缘整齐、中间稍突起，不溶血；肉汤培养基呈均匀混浊，管底部有凝集，呈阳性反应。这些特征都与沙门氏菌的培养特性相符。

表1 引物信息

2.3 生化实验结果 分离菌株在三糖铁琼脂中产酸，斜面变红，底层反应呈阳性并产生硫化氢（H2S）；乳糖、麦芽糖、蔗糖均为阴性反应，对甘露醇和葡萄糖均为产酸产气；枸橼酸盐和MR试验为阳性反应；VP试验和靛基质反应均为阴性。10株菌均符合鸡沙门氏菌的生化特性。

2.4 血清型鉴定 将分离到的10个菌株分别与沙门氏菌A-F多价血清进行玻片凝集试验，结果发现这10个菌株均发生凝集反应，进一步用因子血清与10个分离菌株进行凝集反应，结果发现10个分离菌株均与06、08因子发生凝集，其中06为2株，08为8株。

2.5 16SrRNA PCR扩增、测序及同源比对分析结果

2.5.1 16SrRNA PCR扩增结果和克隆质粒酶切鉴定结果 16SrRNA PCR扩增产物在约1 386 bp处出现一条明亮的条带，克隆质粒酶切片段大小也在1386 bp处，与预期大小一致，见图1。

图1 分离菌的16SrRNA的PCR扩增及酶切鉴定结果

2.5.2 测序及同源比对分析结果 经16SrDNA序列测定，扩增序列长度为1386bp，用Genbank中Blast工具与Genbank序列进行同源比对，结果显示分离菌只与沙门氏菌属中的肠道沙门氏菌种肠道沙门氏菌亚种具有同源性，同源性最高达99%。

2.6 动物实验结果 接种小鼠于感染后8 h开始死亡，16h全部死亡。解剖死亡小鼠可见肺部出血，肝、脾肿大出血，肠胀气，并从死亡小鼠的全部内脏器官中分离到感染菌，对照组小鼠未见异常。

3 小结

根据12户牧民牛群的发病情况、临床表现、剖解变化情况，综合实验室镜检结果、分离培养结果、16SrRNA测序比对结果以及动物实验结果，确诊该病是由沙门氏菌属肠道沙门氏菌种肠道沙门氏菌亚种引起的牦牛沙门氏菌病。

牦牛是草原上重要的经济动物，牦牛沙门氏菌病不仅给牧民造成了严重的经济损失，而且被污染的牦牛产品还可能严重危害人类的健康，因此应加强该病在草原上的防控。

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