L-酪氨酸印迹聚合物的本体聚合法制备及性能

王锦，谢迟，董新荣，雷孝

（湖南农业大学 理学院，湖南 长沙 410128）

分子印迹聚合物（MIPs）是以化合物的分子结构为模板（模板分子或印迹分子）制备的聚合物，是一种具有“记忆”功能的高分子材料。由于MIPs具有选择性地吸附印迹分子的性能，被广泛应用于各种选择性分离与检测方法中[1-3]。

L-酪氨酸（L-Tyr）是合成多肽类激素、抗生素、L-多巴等药物的主要原料，还常用作食品添加剂和配制人工昆虫饲料。L-Tyr主要从含蛋白质的物质（废丝、酪蛋白和玉米等）的水解液中提取，以葡萄糖为原料，经短杆菌出发诱导的l-酪氨酸生产菌发酵而得[4-5]。由于产品组成复杂或L-Tyr含量低，分离纯化、富集检测都较困难。目前L-Tyr的分离纯化及分析检测仍沿用传统方法，试剂用量大，效率低。笔者用本体聚合法制备的L-Tyr印迹聚合物，能从复杂的体系中选择性吸附L-Tyr，有利于对L-Tyr的快速分离纯化及检测。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

L-Tyr （国药集团化学试剂有限公司）；α-甲基丙烯酸（MAA）（天津科密欧化学试剂开发中心）；偶氮二异丁腈（AIBN）（天津科密欧化学试剂开发中心） ；二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA）（美国 CIBA公司，交联度、双酯度98.80%，酯度99.70%，酸度0.08%）；甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA）（上海华谊丙烯酸有限公司）；4-乙烯基吡啶（4-VP）（Alfa Aesar，Johnson Matthey Company）；氮气（含量＞99.5%）。

日立2500荧光分光光度计（日立公司）；恒温水浴振荡器（江苏大地自动化仪器厂）； DL-360A超声清洗仪（上海之信仪器有限公司）；高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；AL-204电子天平（梅特勒-托利多）；索氏提取器；分样筛（74 μm）；84-1磁力搅拌控温电热套（河南巩义市昌旺仪器厂）。

1.2 方 法

1.2.1 L-Tyr印迹聚合物的合成

称取0.364 6 g L-Tyr于锥形瓶中，加入功能单体和15 mL溶剂，磁力搅拌3 h。再加入交联剂、引发剂AIBN 0.06 g，在超声波清洗仪中活化20 min，通氮气5 min，抽真空，置于水浴中热引发并反应24 h，得白色块状聚合物固体，搅碎，取出固体，洗涤，干燥，粉碎，过74 μm分样筛，得粒径为74 μm微球，用醋酸-醋酸钠缓冲溶液清洗模板分子和未聚合的功能单体和交联剂，得到L-Tyr印迹聚合物。

1） 单因素试验。考察功能单体[6]（MAA、4-VP）及用量（模板分子与功能单体量比分别为1∶1、1∶2、1∶4、1∶6）、交联剂（EDMA、HEMA）[7-8]及用量（模板分子与功能单体和交联剂量比分别为1∶4∶10、1∶4∶20、1∶4∶30、1∶4∶40）、反应溶剂[9-10]（乙腈、乙醇、氯仿）和引发温度[11]（0、20、40、60、80 ℃）变化对制备L-Tyr印迹聚合物的影响。以印迹聚合物的萃取效率、选择性吸附L-Tyr的饱和吸附量为指标考察聚合物的性能。

2） 正交试验。用3水平4因素设计正交试验L9（34），以L-Tyr印迹聚合物的萃取效率、选择性吸附L-Tyr的饱和吸附量为指标，考察功能单体MAA用量（4、8、12 mmoL）、交联剂EDMA用量（20、40、60 mmoL）、溶剂种类（乙腈、乙醇、氯仿）、温度（40、60、80 ℃）对制备L-Tyr印迹聚合物的影响。

1.2.2 L-Tyr印迹聚合物的红外光谱分析

分别将模板分子L-Tyr、L-Tyr印迹聚合物MIPs及萃取去除模板分子L-Tyr后的聚合物、空白印迹聚合物 NMIPs（不加模板分子 L-Tyr的聚合物）与KBr（质量比1∶100）混合压片，用傅立叶红外光谱仪在4 000～400 cm-1范围扫描[12]，绘制透光光谱。

1.3 L-Tyr印迹聚合物的性能评价

1.3.1 测定MIPs模板分子萃取效率

将所制备的74 μm微球聚合物MIPs置于真空干燥箱充分干燥后，准确称取其质量，用100 mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液于索式提取器中萃取，除去模板分子，每隔24 h取萃取液测定其荧光强度和荧光值后，更换1次醋酸-醋酸钠缓冲溶液，用荧光分析方法测定L-Tyr的质量浓度，待质量浓度低于1 μg/mL时停止萃取，干燥萃取后的固体，并准确称取其质量，计算萃取效率。

1.3.2 测定MIPs饱和吸附量

分别准确称取50 mg已萃取的的印迹分子聚合物MIPs放入具塞的小试管中，加入2.5 mL 6 mmol/L的L-Tyr的醋酸缓冲溶液，置于恒温水浴振荡器中，25 ℃下振荡24 h，离心10 min，取上清液，用荧光分析方法测定L-Tyr的浓度，计算对L-Tyr的饱和吸附量（被吸附的L-Tyr的量与吸附前聚合物的量的比值）。

1.3.3 MIPs对L-Tyr的选择性吸附

称取已萃取的50 mg MIPs置于具塞小试管中，分别加入5 mL 0.4、0.8、1.2、1.6、1.8、3.0、4.0、5.0、6.0 mmol/L的L-Tyr和L-Phe醋酸缓冲溶液，置于恒温水浴振荡器中，25 ℃下振荡24 h后，离心10 min，取上清液，用荧光分析方法测定L-Tyr的浓度，计算对L-Tyr的吸附量。

2 结果与分析

2.1 功能单体对合成印迹聚合物吸附性能的影响

以4-VP为功能单体时，萃取效率、饱和吸附量只能达到36.36%和22.04 μmol/g，而以MAA为功能单体，其用量为8 mmol时，萃取效率87.78%，饱和吸附量71.87 μmol/g，达到最大值，因而MAA适于L-Tyr印迹聚合物的制备。

2.2 交联剂对合成印迹聚合物吸附性能的影响

在交联剂HEMA的作用下没有聚合物生成，而功能单体MAA与交联剂EDMA的量比为1∶4∶20时，生成的L-Tyr印迹聚合物的萃取效率和饱和吸附量分别可达到为87.46 %和76.01 μmol/g。

2.3 溶剂对合成印迹聚合物吸附性能的影响

结果表明，氯仿极性较弱，为溶剂时所得印迹聚合物的萃取效率、饱和吸附量比另2种溶剂要好，分别为87.73 %和71.87 μmol/g，而乙腈及乙醇为溶剂时，其萃取效率、饱和吸附量仅为55.41 %、52.59 μmol/g和50.04 %、31.30 μmol/g。

2.4 引发温度对合成印迹聚合物吸附性能的影响

试验结果显示，0、20 ℃时制备反应不能进行；40 ℃时制备反应进行不完全，只生成少量的白色聚合物；80 ℃时制备得到的聚合物热稳定性差，呈黄色。60 ℃时制备得到的白色印迹聚合物热稳定好，且萃取效率、饱和吸附量能达到87.31 %、76.97 μmol/g。

单因素试验结果表明，在氯仿溶剂中，以MAA为功能单体，EDMA为交联剂，AIBN为引发剂，L-Tyr与MAA、EDMA、AIBN的量比为10∶40∶200∶1.5，在60 ℃水浴引发聚合制备得到的印迹聚合物萃取效率、饱和吸附量最大。

2.5 正交试验结果

正交试验结果（表1）显示，影响萃取效率、饱和吸附量的因素大小依次为交联剂用量、功能单体用量、温度、溶剂种类；最优化理论条件为B2A2C1D2，即功能单体MAA用量8 mmol，交联剂EDMA 40 mmol，其量比为1∶5，溶剂为氯仿，引发温度60 ℃，为L-Tyr印迹聚合物最佳制备条件，与单因素分析结果一致。

表1 MⅠPs印迹聚合物制备L9（34）正交试验结果Table 1 L9 （34） orthogonal result sand analysis of MⅠPs synthesis

2.6 L-Tyr印迹聚合物红外分析

将模板分子L-Tyr、 萃取前L-Tyr印迹聚合物、萃取后L-Tyr印迹聚合物、空白聚合物进行红外光谱分析[10]并比较（图1）发现，模板分子L-Tyr在3 300 cm-1左右处有氨基（-NH2）的N-H伸缩振动峰，在1 450、1 580、1 512、1 600 cm-1左右处有苯的4个特征吸收峰（谱线1）。谱线2为萃取前L-Tyr印迹聚合物的红外图谱，3 300 cm-1处也有氨基（-NH2）的N-H伸缩振动峰，1 450～1 600 cm-1处也有苯的4个特征吸收峰，显示出模板分子L-Tyr已经与功能单体MAA结合形成了聚合物。经过洗脱剂萃取后得到印迹聚合物MIPs（谱线3），3 300 cm-1处没有氨基（-NH2）的N-H伸缩振动峰，在1 450～1 600 cm-1处也没有苯的4个特征吸收峰，与空白聚合物NMIPs红外图谱（谱线4）显示一致，表明模扳分子L-Tyr已被完全洗脱，得到具有空腔结构的印迹聚合物MIPs。

图1 L-Tyr、萃取前聚合物、MⅠPs、NMⅠPs的红外图谱Fig.1 ⅠR spectra of L-Tyr, the polymer before extracting, MⅠPs and NMⅠPs

2.7 L-Tyr印迹聚合物对 L-Tyr的选择性吸附及吸附等温线

用结构与L-Tyr相似的苯丙氨酸L-Phe，考察L-Tyr印迹聚合物特异性吸附情况，如图2所示。结果表明，在MIPs 对L-Tyr的吸附等温线中，随着L-Tyr标准溶液浓度的升高，MIPs的吸附量逐渐增大，这表明MIPs有固定排列且大小及空间位置与L-Tyr互补的空穴。这种空穴对L-Tyr分子具有“记忆” 功能，因而选择性高，吸附能力强。在MIPs对L-Phe的吸附等温线中，L-Phe的吸附量低，这是因为L-Phe的结构与MIPs中印迹空穴不互补，不能与空穴上的位点形成较强的作用力，而造成MIPs对其结合性不强。在NMIPs对L-Tyr的吸附等温线中，随着L-Tyr标准溶液浓度的升高，NMIPs的吸附量则迅速达到饱和，对于相同浓度的L-Tyr标准溶液，MIPs的吸附量均大于NMIPs的吸附量，且二者的吸附量之差随溶液浓度的增加而增大，这表明组成相同的2种聚合物的空间结构存在明显的差异，NMIPs的吸附主要是非特异性吸附，没有选择性，吸附能力弱。

图2 MⅠPs、NMⅠPs的吸附等温线Fig.2 Adsorptive isotherm of MⅠPs and NMⅠPs

从图2可以看出，在MIPs对L-Tyr的吸附等温线中，印迹分子的吸附等温线的形状类似Langumir模型[12]。随着浓度的增大，MIPs对L-Tyr的吸附量逐渐增大，且在6 mmol/L附近趋于饱和。MIPs对L-Tyr的吸附的数据可用于Scatchard[13]方程，其中MIPs各点的回归方程为Q/C=73.81- 0.597 2Q，R2=0.991 2，为一线性方程，说明MIPs表面具有均一选择性的吸附位点。由 Scatchard方程求得Kd=1.674 7 μmol/mL，最大表观结合位点数Qmax=123.593 4 μmol/g。

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英文编辑：易来宾