产志贺毒素EHEC国内分离株Stx2基因的克隆及生物信息学分析

唐中伟，周志江

（1.山西农业大学生命科学学院，山西 太谷 030801；2.天津大学农业与生物工程学院，天津 300072）

肠道出血性大肠杆菌（EHEC）O157∶H7会引起肠道疾病[1-6]、溶血性尿毒综合征及脑症等并发症[7]，其主要致病因子是志贺毒素（Stx）。Stx分为2类，即Stx1和Stx2。Stx2又有数个变异型，主要是Stx2，Stx2c和Stx2d。Stx2不同变异型对培养细胞和动物的毒性有差异[8]，引起的临床症状轻重也不同[9]。

因此，研究该菌Stx2的分型对阐明毒素的分类、正确诊断疾病和判断疾病的预后都具有重要意义。我国1987年报道从腹泻患者中分离出该菌[10-11]，同时也从牛肉、猪肉及牛粪样品中分离出该菌[12]。我国江苏和广西等地从人和动物多次检测出该菌[13-14]。本研究选取3株国内分离的EHEC菌株，对其Stx2基因进行克隆和测序，以确定它们的分类地位。

1 材料和方法

1.1 菌株和质粒

EHECO157∶H7菌株94H分离自山东一腹泻患者；EHEC O157∶H7菌株094和EHEC O8菌株042分离自牛粪[12]。受体菌DH5α、质粒载体pMD-18 Tvector为宝生物大连有限公司产品。

1.2 试剂

PCR试剂盒、氨苄青霉素（AP）和DL 2000 Marker购自宝生物大连有限公司，DNA回收试剂盒购自北京鼎国生物技术中心。

1.3 Stx2基因的扩增

根据Stx2基因序列设计合成1对引物，分别是 Stx2u:5′GGAACACCTGTATATGAAGTG3′和 Stx2d:5′GTTACCCACATACCACGAATG3′。两引物跨越整个Stx2基因，预期扩增片段大小为1282 bp。PCR后做琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，于紫外检测仪下观察。

1.4 Stx2基因的连接和转化

将PCR产物纯化后，连接到pMD－18 T vector，转化感受态细菌DH5α，在含AP的SOB平板培养基中37℃过夜培养，挑取白色菌落，接种于含AP的LB培养基中，37℃过夜培养，提取重组质粒，再按上述PCR扩增条件鉴定重组效果。

1.5 Stx2基因的核苷酸序列分析

由宝生物大连有限公司进行序列测定。

2 结果与分析

2.1 Stx2基因的扩增和克隆

经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，所得产物约1282 bp，与预期大小相符。经重组转化后，从转化子提取重组质粒作为模板，再做PCR，同样扩增出了约1282 bp DNA片段（图1），表明已克隆出各菌株的Stx2基因。

2.2 Stx2基因的核苷酸序列分析及其编码的氨基酸序列分析

用Stx2u和Stx2d引物分别测得3株菌的Stx2的序列，用计算机软件DNASIS分析它们与业已发表的Stx2，Stx2c，Stx2d序列的同源性。

经分析（图2），EHEC 94H的Stx2序列与标准株Stx2核苷酸序列同源性为99.8%，EHEC 042的Stx2序列与Stx2核苷酸序列同源性为98.9%，EHEC 094的Stx2序列与Stx2核苷酸序列同源性为97.9%。

经分析（图3），EHEC 94H的Stx2序列与Stx2c核苷酸序列同源性为99.5%，EHEC 042的Stx2序列与Stx2c核苷酸序列同源性为98.9%，EHEC 094的Stx2序列与Stx2c核苷酸序列同源性为98.0%。

经分析（图4），94H的Stx2序列与Stx2d核苷酸序列同源性为90.9%，042的Stx2序列与Stx2d核苷酸序列同源性为90.5%，094的Stx2序列与Stx2d核苷酸序列同源性为87.1%。

经分析（图5），EHEC 94H与042的Stx2核苷酸序列同源性为98.8%，与094的Stx2核苷酸序列同源性为97.9%。

Stx2，Stx2c，Stx2d 序 列 和 94H，094，042 的Stx2序列分别编码的B亚基氨基酸序列比较如下（每组从上至下依次为Stx2，Stx2c，Stx2d序列和94H，042，094的Stx2序列）:

经比较（图6），EHEC 094的Stx2序列编码的B亚基与Stx2d序列编码的B亚基氨基酸序列同源性为100%，EHEC 94H的Stx2序列编码的B亚基与Stx2序列编码的B亚基氨基酸序列同源性为100%；EHEC 042的Stx2序列编码的B亚基与Stx2序列编码的B亚基氨基酸序列同源性为97.7%。

3 讨论

Stx2变异型的不同，表现为它们抗原性和毒性有所不同，主要是它们B亚基序列的不同所致，而B亚基的不同又决定了毒素与什么样的受体结合或决定与受体结合的亲疏。由于94H，094，042的Stx2序列核苷酸密码发生了改变，因而编码出的氨基酸也发生了改变。特别是B亚基氨基酸序列发生改变，对于3株EHEC国内分离菌株的生物学特性会产生一定的影响。

经DNASIS软件分析，从人类患者分离的94H的Stx2序列编码的B亚基与标准株Stx2序列编码的B亚基氨基酸序列同源性为100%；从牛粪分离的菌株042的Stx2序列编码的B亚基氨基酸序列与标准株Stx2序列编码的B亚基的同源性为97.7%，属于较强毒株；从牛粪分离的菌株094的Stx2序列编码的B亚基与强毒株Stx2d编码的B亚基氨基酸序列同源性为100%。目前，已证明Stx2d的毒性大于Stx2，由此可以预见，094产生的毒素与受体结合强度较94H和042强，可能导致的毒性也较强。

上述分析明确了我国分离的产志贺毒素的大肠杆菌，特别是大肠杆菌O157∶H7的Stx2基因型及其毒素分型，这为开展分子流行病学调查和及时准确诊治其感染，控制其在我国的流行，也为下一步研究菌苗和抗体提供了依据。

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