人体头发中兴奋剂分析方法研究进展

安丽媛 徐友宣

1 北京体育大学（北京 100084） 2 国家体育总局反兴奋剂中心

世 界 反 兴 奋 剂 组 织（World Anti-Doping Agency）规定兴奋剂检测的生物样本是尿样和血样。尿样和血样存在尿样收集的隐私性、易被稀释或替换、检测时限短、不易保存、外源与内源物质难区分和损伤性等问题，因此一些研究者采用汗液、唾液、毛发、指甲等生物样本进行代替检测。毛发由于具有性质稳定、易取材、易保存、检出时限长、无创性和反映用药史等优点而越来越多地被采用。

有关头发中药物检测的研究报道很多，主要集中在法医毒物学、临床毒物学、职业医学以及兴奋剂控制领域。头发中兴奋剂的检测仍处于发展阶段，对于头发中所常见的刺激剂、麻醉剂、大麻（酚）类的检测，代谢物的气相色谱-质谱（GC/MS）分析方法研究及吸收和代谢机理研究已经成熟，但对于其它兴奋剂的研究尚处于起步阶段。近几年，一些研究者［1-3］利用牛、马和豚鼠等动物进行实验，探讨选择性好、灵敏度高的检测方法和回收率高的预处理方法，同时还分析了药物的代谢规律，剂量与头发中浓度关系，尿、血、头发结果之间的关系［4］。本文对头发中兴奋剂检测的几种方法做一评述。

1 头发中兴奋剂的吸收和代谢机制

目前对兴奋剂进入头发的确切机制尚不清楚，一般研究［5］认为，兴奋剂及其主要代谢物进入头发有3个途径：（1）主要通过毛细血管被动扩散进入；（2）头发附近的汗腺、皮脂腺和皮肤分泌的兴奋剂及其代谢物通过表层进入；（3）外界环境污染。因为头发主要成分为黑色素、角蛋白和脂质，所以兴奋剂进入头发受黑色素含量、兴奋剂本身亲脂性和碱性这3个主要因素影响。一般来说，中性亲脂性的兴奋剂容易穿过膜并扩散到基质细胞中，碱性兴奋剂与黑色素有亲和性而易进入头发，因此黑色素的含量只对碱性兴奋剂吸收有影响，对于中性兴奋剂的吸收没有影响。碱性和中性的兴奋剂更易进入头发，相反，酸性物质如水杨酸、2-丙基戊酸和四氢大麻酚等不易进入头发。Nakahara等［6-9］利用黑灰系大鼠系统地研究了药物结构对药物进入头发的影响，这些研究利用吸收率（IRC，同一时间头发兴奋剂含量与血浆兴奋剂含量的比）定量描述了药物在头发中的堆积速率，证实了以上结论。

兴奋剂在头发中的稳定性受该兴奋剂化学结构和极性的影响。兴奋剂一般在头发中的稳定性很好。随着时间推移，头发中的兴奋剂或其代谢物会减少，减少速率取决于兴奋剂与头发基质的结合性。在外部环境中暴露时间越长，头发基质的极性越大，一般情况下，极性大的代谢物比极性小的母体兴奋剂更易在头发中保留，所以代谢物比母体存留时间长。

2 分析方法研究

头发中兴奋剂的分析方法一般包括取样和保存、洗涤、预处理、检测方法等步骤，下面从这些方面进行讨论。

2.1 取样和保存

研究显示［10］，头顶后部头发生长速率的变异系数为15.6%，比头部其他区域的变异系数（30.5 %）小，所以选用头顶后部为取发的区域。考虑到受外部污染少的因素，剪取的头发越靠近头皮越好，但不能带上毛囊，因为毛囊可以在促肾上腺皮质激素的刺激下产生皮质醇。一般用干净的剪刀从头上剪取50～100 mg 头发，然后装于信封中密封，在常温下保存。

2.2 洗涤

头发检测协会（the Society of Hair Testing）规定检测的头发需用热水、二氯甲烷和甲醇冲洗去污。Kintz等［11-13］采用室温下二氯甲烷冲洗，Gambelunghe等［14］对两次的冲洗液用气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）检测来确保外源性污染除尽。Rambaud等［15］考察了二氯甲烷洗涤对头发分析结果的影响，发现在给药后10天内，对头发的完整洗涤除去了50% ～ 70%的甲基睾酮，这是因为部分药物存在于头发的浅表层中而易被洗掉。很多研究采用磷酸缓冲液（pH = 7.4）、0.1% 十二烷基硫酸钠、己烷、乙酸乙酯、丙酮、10 % 吐温80等，一般都需几种溶剂反复洗涤，从而达到去除极性和非极性污染物的目的。Aqai等［16］进行了洗、剪、粉碎这3个步骤对头发中类固醇类影响的研究，比较了非有机相水、1% 十二烷基磷酸钠和不同浓度的甲醇溶液这3类洗涤液的效果，发现1% 十二烷基磷酸钠和甲醇溶液（< 20%）的效果比水好，剪过的比没有剪的回收率高20%，粉碎的样品更容易得到好的结果。对于洗涤步骤各研究不尽相同，并没有统一的标准，笔者认为只要确保洗除外部污染并尽量减少内部药物损失即可。

2.3 预处理

2.3.1 头发的消解

头发消解是指通过酸解或碱解等其它方法使待检测药物从头发基质中游离出来，从而达到检测目的的过程。以下介绍毛发中兴奋剂检测的一些消解方法。

表1 毛发中兴奋剂消解方法的比较

合成类固醇的现有水解方法有酸水解［35］、碱水解、甲醇提取法［34］等，但是绝大多数研究者对检测类固醇都采用碱解法［11-13，18］，检测类固醇酯类采用甲醇超声法，同时检测酯和非酯时才用先甲醇萃取后碱解法［15，17，19］，这是由于头发中合成类固醇类浓度为pg/mg的水平，为了获得较高的回收率，绝大部分研究者摒弃了酸水解法，而选择释放药物更为完全的碱消化法。此外，Nielen等［1］在分析17β-睾酮酯和17β-宝丹酮十一烷酸酯时用2 ml 25 mmol/L的三（2-羰基乙基）磷盐酸盐（还原剂）消解1 小时，大部分酯类的最低检测限均在2～5 ng/g。

糖皮质激素的水解有缓冲溶液消解［30，36］、酶解［21］、甲醇提取法［26，33］等。Raul等［30］用2 ml瑟伦森缓冲液（38.8 ml 9.07 g/L磷酸二氢钾和61.2 ml 11.87 g/L磷酸氢二钠，pH =7.6）在40℃下消解糖皮质激素16小时，发现回收率低，推测可能是其在缓冲液中不太稳定。Van den hauwea等［21］探讨了从头发中提取糖皮质激素的甲醇超声提取、酸消解、碱消解和酶消解这几种方法的优劣，得出碱消解无检测物（因为有些糖皮质激素在碱条件下不稳定），酸消解和醇超声有信号但是其信噪比（S/N）分别是酶消解的27%和40%，最后选用酶消解。

β-阻断剂和β2-激动剂的水解有碱消解［20，22-24］、酸消解［27］等，由于β-阻断剂和β2-激动剂在碱性和酸性条件下都稳定，碱消解比酸消解节省时间和消解得更彻底，所以大多数研究者采用碱解的方法。

刺激剂类、麻醉剂类和大麻类的水解有甲醇超声消解［25］、酸解［28］、碱解［25］、缓冲液解［29］和酶解［31］等方法，对于一些含酯基如可卡因、6-单乙酰吗啡等的药物最好避免碱解。Skender等［25］鉴于可卡因、6-单乙酰吗啡在碱中不稳定，故对吗啡、可卡因、6-单乙酰吗啡等采用2 ml 甲醇在40 ℃ 消解18 h，而对安非他明类则采用1 mol/L氢氧化钠碱解；此外，Kronstrand等［37］用0.5 ml流动相A（10:10:80，乙腈:甲醇: 20 mM甲酸缓冲液）在超声水浴振荡条件下于37℃消解18小时。

2.3.2 头发中兴奋剂的纯化

2.3.2.1 合成类固醇的纯化

类固醇的纯化采用液液萃取［18，19］、固相萃取或固液萃取相结合［15，17］的方法。Deshmukh 等［18］进行碱消解后，用1 ml盐酸和2 ml磷酸缓冲（pH=7.0）中和，然后用戊烷液液萃取，震荡后离心，有机相透过PTFE膜（0.45 μm），吹干加入100 μl乙腈进行LC-MS/MS检测。Kintz等［11-13］从头发中检测诺龙、美替诺龙、大力补时首先碱解头发，接着用1 ml 1 mol/L盐酸和2 ml 1 mol/L磷酸缓冲溶液（pH = 7.0）中和，中和后用Isolute C18柱萃取，用1 ml去离子水洗两次，洗去离子型杂质，再用3份0.5 ml 甲醇把分析物洗脱掉，蒸发掉溶剂后加入1 ml 0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH=7），接着加入100 mg 碳酸钠：碳酸氢钠（1:10， w:w）（加碱为了进一步去除酸性物质）和2 ml 戊烷液液萃取。Rambaud等［15，17］采用先甲醇超声后碱解的水解方法检测类固醇及其酯，首先是液液萃取，酯类的甲醇萃取液中加入2 ml 去离子水和100 μl 0.1 mol/L氢氧化钠去除酸性杂质（酯能在此条件下稳定，1个小时内消解少于2%），然后2 ml乙酸乙酯萃取，类固醇的消解物同样用2 ml乙酸乙酯萃取，两者混合进行固相萃取。首先氨基柱萃取去除离子化杂质，接着二氧化硅柱进一步固相萃取纯化，睾酮和诺龙的酯类用1 ml氯仿洗脱，非酯类用两次1 ml氯仿和乙酸乙酯混合物（3:1，v/v）洗脱，除去了其他的更多的极性杂质。

类固醇的酯的纯化采用液液萃取、固相萃取和固液萃取相结合［15，17］等方法。Nielen等［1］在消解液中加入4 ml甲醇提取，再加入4 ml水用C18柱固相萃取，用2 ml乙腈和2 ml乙酸乙酯洗脱。严慧等［19］将头发用甲醇消解后，采用乙酸乙酯萃取酯类，并在研究中比较了液液萃取和固相萃取，得出液萃比固萃回收率高。

对于纯化步骤，头发中含有大量的蛋白质和少量脂质，从以往的实验结果分析，笔者认为固液萃取比液液萃取更有利于去除蛋白质和脂质，而且也适用于低浓度药物检测。

2.3.2.2 糖皮质激素的纯化

糖皮质激素的纯化采用液液萃取［33］、固相萃取［21，26，36］和固液萃取［30］相结合等方式。Raul等［30］用缓冲液消解后离心，上清液用Isolute C18柱萃取，用1 ml 丙酮/去离子水（2:8，v/v），1 ml去离子水和1 ml己烷冲洗，最后用3份0.5 ml乙醇洗脱。吹干乙醇后，加入0.5 ml 0.2 mol/L氢氧化钠，用3 ml乙醚液液萃取。Van den hauwea等［21］进行酶解后，用2 ml甲醇萃取2次，且吹干后用1 ml乙醇超声10分钟，加入6 ml水，用C18柱固相萃取，用5 ml丙酮/水（20:80，v/v）、5 ml水和5 ml己烷冲洗，用6 ml乙醚洗脱，吹干加入流动相。Gaillard等［33］用1 ml甲醇在60℃下消解2小时，乙醇萃取物用4 ml水稀释，离心5分钟转移进Toxi-Tube A进一步纯化，离心后有机相蒸发后加入80 μl乙腈和水混合液（50:50），震荡混合之后离心3分钟，取60 μl澄清层注入分析。对于糖皮质纯化过程，大多都采用固相萃取，笔者认为由于糖皮质激素的亲油性，易与头发中的油脂结合，固相萃取可以去除油脂，提高糖皮质激素回收率。

2.3.2.3 β-阻断剂和β2-激动剂的纯化

β-阻断剂和β2-激动剂的纯化采用液液萃取［23］、固相萃取［22，27］和固液萃取［24］等方法。Kintz等［27］进行酸消解后加入0.1 mol/L氢氧化钠和2 ml碳酸氢盐的缓冲液（pH = 8.6）中和，用Isolute C18柱固相萃取后用三甲基硼氧六环－乙酸乙酯的混和物衍生成甲基硼酸衍生物检测，这些检测物的最低检测限（LOD）为2～10 pg/mg，回收率为37～100%。Pelander等［22］利用液相色谱-时间飞行质谱（LC-TOFMS）检测头发中的β-阻断剂，碱解冷却后用盐酸调到pH=7加入水，取1ml溶液加入内标和2 ml磷酸缓冲液，用Isolute HCX-5 （130 mg）柱固相萃取，用1 ml磷酸缓冲液和3 ml 甲醇洗，最后碱性部分用3 ml新配制的乙酸乙酯-氨水（98:2，v/v）洗脱，蒸干加入150 μl乙腈-0.1%甲酸（1:9，v/v）分析。Fente等［23］用GC-MS检测牛毛中的克伦特罗，碱解后用柠檬酸钠缓冲液（pH = 4.8）把pH值调到12，25 ml二氯甲烷在37℃下萃取4小时，浓缩有机相后加入100 μl双（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺（BSFTA）和乙酸乙酯（1:1，v/v）衍生化，用25 μl乙酸乙酯溶解。Machnik等［24］用GC–HRMS检测克伦特罗，5 mg 头发碱解后加入3 ml水，后用5 ml叔丁甲基醚萃取，蒸发后用0.1 ml甲醇溶解和5 ml磷酸缓冲液稀释，用免疫亲和性柱子分离克伦特罗，先用水和15%甲醇溶液洗杂质，再用3 ml乙醇/冰醋酸（80:20）洗脱，干燥后衍生化。以上可以看出大多数β-阻断剂和β2-激动剂都采用碱消解，并且对于大量的碱性药物用固相萃取柱较好。

2.3.2.4 刺激剂类、麻醉剂类和大麻类的纯化

刺激剂类、麻醉剂类和大麻类的纯化采用液液萃取［25］和固相萃取［25，28，31］等方法。Cordero等［28］将10～30 mg头发酸解冷却后加入2 ml 0.1 mol/ L的磷酸缓冲液和200 μl 1 mol/LKCl调节pH=7.0 ± 0.4，用Bakerbond Narc-2混合模式固相萃取柱进一步纯化，最后用氯仿:异丙醇（80:20，2 ml）洗脱酸性和中性药物，接着用氯仿:异丙醇:氢氧化铵（80:20:3，2 ml）洗脱碱性药物，吹干用甲基双本氟醋酰胺（MBTFA）和甲基三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺（MSTFA）+1%TCMS（30 μl）进行两次衍生化后用GC-MS检测。该实验检测了鸦片制剂、安非他明类、大麻类、安定类和去甲西泮等药物的回收率为73 ～ 100%。Moeller等［31］对10～30 mg头发用酶消解后，将上清液加入2 ml磷酸缓冲液，振荡离心上清液后用Chromabond C18柱萃取，用3×500 μl的丙酮/二氯甲烷（1:3）洗脱，挥干后用100 μl五氟丙酸酐（PFPA）和70 μl 五氟丙醇（PFPOH）在60℃衍生化30 min后用GC-MS检测。Skender等［25］对吗啡、可卡因、6-单乙酰吗啡等采用甲醇消解后固相萃取，用丙酸酐/嘧啶衍生化，最后用GC/MS检测，而对安非他明类则采用碱解，后乙酸乙酯液萃，七氟丁酸酐衍生化，最后用GC/MS检测。此外Kronstrand等［37］对10～50 mg 头发和0.5 ml 流动相A（10:10:80，乙腈:甲醇:20 mM甲酸缓冲液）在超声水浴振荡条件下于37℃消解18 h，离心后有机相进行LC–MS–MS检测，该实验主要检测了吗啡、6-单乙酰吗啡、安非他明等药物，回收率77～100%。这几种方法相比最后一种方法更简便且回收率较高，并且吗啡、6-单乙酰吗啡、安非他明等药物可以同时检测。

2.4 检测方法

研究者们以往采用的检测方法是GC-MS、GC-MS/MS、LC-MS、LC-MS/MS、LC-TOFMS和GC-HRMS等。对目标物浓度低的头发而言，GC-MS和LC-MS的灵敏度和分辨率与GC-MS/ MS、LC-MS/MS相比都有所欠缺。GC- HRMS是选择离子的精确质量进行测定，其质量可精确到小数点后4位，降低了背景干扰声，提高了测量的信噪比。GC-MS/MS两个分析器也提高了信噪比，以往的GC-HRMS和GC-MS/MS检测合成类固醇的灵敏度没有明显区别，但GC-MS/MS测定睾酮酯类的灵敏度稍低于高分辨率质谱［19］。GC-MS/MS和GC-HRMS与LC-MS/MS和LC-TOFMS相比，后者可以适用不同极性的目标物，预处理简单，无需衍生化，分析时间短。LC-TOFMS和LC/MS/MS相比，前者定性能力强，后者定量能力强。笔者认为，可以对几种检测方法进行对比分析，探讨其不同优势。

3 存在问题

确定头发中兴奋剂的检测阈值十分重要。目前头发中药物的兴奋剂检测还不具有明确的阈值，药物滥用和精神健康服务管理局（Substance Abuse and Mental Health Services Administration）和头发检测协会（the Society of Hair Testing）对头发中的大麻类、可卡因、鸦片类、安非他明类等规定了界限。一些研究者对兴奋剂中内源性药物的阈值检测进行研究，测定正常人群头发中内源性类固醇激素的水平，为内源性类固醇兴奋剂滥用的判断提供了方法和依据，如有研究［39］通过GC-MS的方法检测雄烯二醇浓度为9～19 pg/mg，睾酮为13～24 pg/ mg，雄烯二酮为5 ～ 15 pg/mg，普拉雄酮（DHEA）为21～56 pg/mg，双氢睾酮为2～8 pg/mg，17α-羟基孕酮为1～7 pg/mg。Kintz等［40］和沈敏等［41］也检测了头发中内源性类固醇的含量，沈敏研究证明，睾酮和DHEA的浓度差值与血液中的差值相一致。Raul等［42］得出内源性皮质醇的浓度范围为5～91 pg/mg （平均18 pg/mg），可的松的浓度范围为12～163 pg/mg（平均70 pg/mg），同时还得出头发中可的松比皮质醇的浓度高（与血液相反）是由于在进入头发之前，皮质醇就被II型11 HSD（H-hydroxysteroid-dehydrogenase）转变成可的松。头发的颜色对其浓度没有影响，性别的影响存在，但未被统计，年龄对其有一定影响，例如20岁以前人头发中可的松的浓度明显较高。

单次摄药是否能够被检测对于头发中赛内兴奋剂检测具有重要意义。Segura等［35］对豚鼠腹腔注射类固醇药物，由于检测方法不灵敏、注射剂量太少和检测时间设置问题等，得出了单次注射不能在毛发中检测到的结论。Shen等［3］研究显示，单次摄药后对毛发进行检测（因美替诺龙的结构原因，其不易被头发吸收，使用多次才有可能被检测到），最高浓度大部分出现在注射后2 ～ 4天，司坦唑醇在第10天。这就为采取样品提供了最佳的时间依据，也为对于一次性服用药物的毛发检测提供了可能性。

头发采集中可能会遇到染发、秃头和剃光等情况。为了找到头发的替代品，Kintz等［43］对头发、阴毛、腋毛中DHEA和睾酮的生理浓度进行了比较，除了腋毛中DHEA的浓度特别高，总体上药物浓度在头发和非头发中都是类似的。Thieme等［4］对身体不同部位毛发浓度研究得出不同的结论：阴毛、手臂、腿毛药物浓度明显高于头发，他认为不同部位毛发药物浓度的不同与生长动力学、药物结合率以及生物转化有关。

关于头发检测是否存在种族差异问题，沈敏等［41］对比外国其他一些研究者关于内源性固醇类的研究数据表明，中国人与外国人并没有明显区别，但是易与黑色素结合的药物还是容易受头发颜色的影响。

药物的用药量与头发中药物及其代谢物浓度的关系也有待进一步研究，Pe´pin等［44］根据大量的滥用可卡因用量多少的描述，把其分成低、中、高3个水平，并检测其相应的浓度，如低浓度滥用者的可卡因浓度低于4 ng/mg。Pascal Kintz等［43］通过检测5年中阳性尿样的运动员头发中可卡因的浓度，发现约38%的阳性运动员头发中可卡因浓度为5～20 ng/mg，约25%的阳性运动员头发中可卡因浓度为1～5 ng/mg。

4 展望

1999年，头发检测协会（the Society of Hair Testing）表示头发检测不能代替传统尿样检测，只能作为补充。尿样检测结果阳性不能被头发检测阴性否决，而在尿样阴性情况下，头发检测阳性表明在采样前的一段时间里接触过药物。在反兴奋剂领域头发检测对于赛外禁止的药物具有重要意义，但是对于有含量界限的药物尚需研究并确定头发中药物的检测阈值。

总之，由于头发样品具有性质稳定、易取材、易保存、检出时限长、无创性，反映用药史等优点，因此其用于尿样检测补充有广阔的前景：当尿检阳性时，头发检测可区分是单次摄药还是长期摄药；头发分析的长检测时限和反映用药史的特点使其可用于赛外抽检，替代“飞行药检”；头发中母体大于代谢物的规律有助于鉴别进入体内药物分子的形式（酯类或衍生物），有望区分外源性和内源性物质；头发易收集、易保存，可进行二次采样。同时，头发样品的兴奋剂检测还存在许多问题：头发兴奋剂的检测阈值尚不清楚；头发中兴奋剂的分析方法有待建立；头发中兴奋剂的吸收和代谢情况尚不清楚；尿样、血样和头发中兴奋剂浓度关系尚未确立；不同区域、种族之间是否存在差异等问题，尚待进一步研究。

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