eNOS基因单核苷酸多态性与2型糖尿病合并高血压相关性的研究

朱海超,于世军,杨康鹃,朱玉琢*

（1.延边大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室,吉林延边 133000;2.吉林大学白求恩医学院 遗传系,吉林 长春 130021）

2型糖尿病合并高血压是临床常见的问题,合并高血压机率高达30%-50%[1]。患者一旦出现高血压病,并发症有加重的表现。研究结果表明2型糖尿病合并高血压时在糖代谢异常及压力负荷的双重刺激下,加重了左心室心肌肥厚和功能受损。与单纯高血压比较,高血压并存糖尿病患者的左心室及左心室重量增大及主动脉增宽,患者心脏结构和功能的异常较单纯高血压和2型糖尿病时更复杂和更严重,患者心脑血管疾病发生率明显高于单纯糖尿病组患者[2-4]。而降低糖尿病患者的血压可以降低脑卒中发生率的35%-40%、心肌梗死发生率的20%-25%及心衰发生率的50%[5]。因此,寻找和建立有效的糖尿病合并高血压发病风险预测和发病前诊断技术,在临床上具有重要实用价值。本研究旨在探讨吉林地区汉族人内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因第7外显子单核苷酸（G894T）多态性与糖尿病合并高血压的关系,为临床早期发现和治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病例选择

本研究中所有2型糖尿病患者均来自吉林大学第一医院的住院和门诊患者,每个病人都根据1997年美国糖尿病协会（ADA）糖尿病诊断标准进行了严格的诊断。空腹血浆葡萄糖≥7.0mmol/L或随机血浆葡萄糖≥11.1 mmol/L或OGTT试验2小时血糖≥11.1mmol/L,符合上述标准之一者,在次日复诊仍符合三条标准之一者确诊为2型糖尿病患者。高血压的诊断标准参照WHO的标准:收缩压≥140 mmHg和/或舒张压≥90mmHg。有明确高血压病史且长期服用降压药物者也包括在内。所有病例按照糖尿病病人是否患有高血压分为两组,单纯糖尿病患者组和糖尿病伴有高血压组。单纯糖尿病组患者共有 45人,男/女=17/28,平均年龄 48±8.54岁。糖尿病合并高血压组患者共有35人,男/女=13/22,平均年龄 51±7.46岁。正常对照组 36例,平均年龄47±8.44岁均来自吉林大学第一临床医学院药理基地,均为吉林地区体检的健康人。患者组与对照组均为吉林地区汉族人,各研究对象间均无血缘关系。所有入选患者的一般情况及临床资料见表1。

1.2 实验方法

1.2.1 血样采集 所有受试对象均于晨起空腹取静脉血2m l,2%EDTA抗凝。

1.2.2 基因组DNA的提取 采用DNA抽提试剂盒（Promega北京生物技术有限公司）快速抽提人外周血中白细胞基因组DNA,操作方法按说明书进行。

1.2.3 聚合酶链实验 利用引物设计软件Oligo6.0按照引物设计原则设计出引物。

eNOS基因第7外显子894G→T位点引物:上游引 物:5′-CAAGGTGGAGAATGAGGAAAC-3′,下 游 引物:5′-CTTTAGAGGCTCAGGGATGGC-3′。 用 PCR 扩增仪,预变性为94℃,持续5min;继之30个周期,每个周期中变性94℃持续1min;退火58℃持续2 min,延伸 72℃,持续2 min;循环结束后终末延伸72℃,持续10min。用BanII限制性内切酶消化扩增产物,反应采用20μl的反应体系。加样完毕将上述反应液混合均匀,瞬时离心5 s。盖好Eppendorf离心管,放入恒温水浴锅中,37℃水浴5 h。向管内添加10×loading buffer（含1%SDS）2μl,使内切酶变性以终止反应。

1.2.4 琼脂糖凝胶电泳 用移液器取10μl酶切产物以2%的琼脂糖凝胶电泳检测。（在80 V电压下泳动30min）,溴化乙锭染色,在透射式紫外线灯下观察检测结果。

1.3 统计方法

观察荧光带并确认读取各样本基因型,计算各组eNOS基因型频率和等位基因频率,然后经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验。各组间等位基因频率比较用χ2检验。用SPSS10.0 forwindows软件处理数据。

2 结果

2.1 eNOS基因的各基因型鉴定 两个位点不同等位基因的判别 894G→T位点:经过PCR扩增的产物得到430 bp,经过BanII内切酶酶切后得到312 bp和118 bp两个片段,是野生型基因GG;酶切后产物既得到430 bp又得到312 bp和118 bp三条片段是突变型杂合子GT;酶切产物只得到一条片段430bp,是突变型纯合子TT,结果见图1。

图1 eNOS基因第7外显子894G→T多态位点 Ban II酶切后2%琼脂糖凝胶电泳结果

2.2 基因型频率和等位基因频率比较 eNOS基因第7外显子894G→T位点单纯糖尿病组（DM组）,糖尿病合并高血压组（DM+HP组）和对照组（NC组）基因型频率和等位基因频率分布,见表2。

表2 eNOS基因第7外显子894G→T位点基因型频率和等位基因频率分布

3 讨论

一氧化氮合酶（eNOS）是生成NO的限速酶。一氧化氮合酶（eNOS）基因位于人染色体的7q35～q36区,长约21kb,包括26个外显子和25个内含子。现已证实的eNOS基因的多态位点有10个。包括:两个微卫星序列,两个串联重复序列,6个单核昔酸多态性位点。本研究关注第7外显子单核苷酸（G894T）多态性多态性。

国内外对eNOS基因G894T多态性与原发性高血压的关系存在着巨大的差异。而对eNOS基因G894T多态性与糖尿病合并高血压的研究很少。本研究按有无高血压分为糖尿病合并高血压组（DM+HP）和单纯糖尿病组（DM）时,基因型的分析揭示DM+HP组（GG型51.4%,GT型42.9%,TT型5.7%）较NC组（GG型83.3%,GT型8.3%,TT型8.3%.）分布有明显差异（P＜0.05）,T等位基因频率亦有显著差异（DM+HP组等位基因频率分别为G型为72.9%,T型为27.1%NC组中等位基因频率分别为G型为87.5%,T型为12.5%）而DM组（GG型66.7%,ID型28.9%,DD型4.4%）与DM+HP组（GG型51.4%,GT型42.9%,TT型5.7%）和NC组（GG型83.3%,GT型8.3%,TT型8.3%）无明显差异（P＞0.05）。T等位基因比较也是没有差异（P＞0.05）。

[1]Sowers JR,Ep steinM.Diabetesmellitusand associated hypertension,vascular disease,and nephropathy:an update[J].Hypertension,1995,26（8）:869.

[2]张立权,丁绍平,胡东升.2型糖尿病合并高血压患者左心室结构和功能变化[J].岭南心血管病杂志,2007,13（6）:214.

[3]周方明,祝之明,谭建聪,等.高血压合并糖尿病患者心脏结构与功能的变化特点[J].中国糖尿病杂志,2002,10（4）:199.

[4]白 璐,乔 晶,高晓虹,等.2型糖尿病合并高血压对心脑血管疾病的影响[J].中国误诊学杂志,2007,6（3）:1201.

[5]Chobanian AV,Bak ris GL,Black HR,et al.Seventh Report of the joint NationalCommitteeon prevention,Detection,Evaluation,and Treatmentof High Blood Pressure[J].JAMA,2003,289（12）:2560.