抗真菌药物的新作用靶点

陈文峰 张子平 程波

(福建医科大学附属第一医院皮肤科，福州350005)

随着AIDS患者、器官移植患者以及癌症患者的增多，抗菌药、免疫抑制剂、化疗药物和放疗的广泛应用，以及侵入性诊断和治疗技术的运用，机会致病性真菌感染率明显升高。引起侵入性真菌感染的最常见致病菌包括念珠菌属(占侵入性真菌感染病例的70% ～90%)和曲霉菌 (10% ～20%)，机会致病菌感染在这些免疫系统受损的患者可引起很高的死亡率［1，2］。现在机会致病性真菌的感染已成为重要的公共健康问题。当前，临床上应用的抗真菌药物主要包括:作用于真菌细胞膜，损害细胞膜脂质结构和功能的多烯类(两性霉素B及制霉菌素);作用于真菌细胞P450依赖酶的唑类 (如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等);作用于角鲨烯环氧化酶的丙烯胺类 (如特比萘芬)以及干扰真菌核酸合成的嘧啶类 (如5-氟胞嘧啶)等。这些抗真菌药都存在一定的毒副作用，比如两性霉素B具有严重的肾毒性，唑类药物在作用于真菌P450依赖酶的同时对哺乳动物的P450依赖酶也具有抑制作用，从而出现一定的肝毒性等［3］。而且，随着临床上预防性的用药及治疗上的大量应用，出现了越来越多的耐药株［4，5］。因此寻找新的抗真菌药物的药靶，研究开发出高效、安全的广谱抗真菌药物成了当务之急。

1 抗真菌药作用靶点必需具备的条件

通常一个理想抗真菌药物的作用靶点必需具备以下几点:①所作用的靶点存在于大部分的真菌。②所作用的靶点在哺乳动物细胞中不存在。③这个靶点必需与真菌的致病过程密切相关。④具有简单的高通量筛选化合物的方法［6］。真菌和哺乳动物都是真核生物，在代谢和信号转导通路方面具有很大的相似性，要找到一个真菌特异性的靶点并非易事［7］。然而，近年来，随着分子生物学的发展，对与真菌活力和毒力有关的基因的深入研究，发现了一些很有潜力的药靶。

2 抗真菌药物的新作用靶点

2.1 真菌细胞壁

真菌细胞壁是真菌细胞所独有的结构，不存在于哺乳动物细胞中，细胞壁代谢与真菌生长和分裂密切相关，其作用是控制细胞内压力以维持菌体的完整性，若细胞壁破坏，则导致菌体溶解死亡。真菌细胞壁成分包括:几丁质、β-(1，3)-D-葡聚糖和甘露糖蛋白。通过抑制细胞壁组分的合成或破坏其结构，可以达到抑制、杀灭真菌的目的。

以棘白菌素类药物为代表的β-(1，3)-D-葡聚糖抑制剂就是以真菌细胞壁为靶点，特异性抑制真菌细胞壁β-(1，3)-D-葡聚糖的合成，破坏真菌细胞壁的完整性，使真菌细胞内渗透压不稳定，最终导致真菌细胞溶解死亡。这类药物除念珠菌属之外，还具有对曲霉菌属和卡氏肺孢子虫的活性，但对新型隐球菌无效。由于哺乳动物不存在β-(1，3)-D-葡聚糖，因此不会对哺乳动物产生类似两性霉素B作用机制为基础的毒性作用，患者耐受性好。目前已上市的有卡泊芬净、而米卡芬净及阿尼芬净。Aminocandin是一种对曲霉菌和念珠菌属具有广谱体外活性的新的棘球白素类药物，目前正处于Ⅲ期临床试验中［8，9］。

尼柯霉素类药物是几丁质合成酶抑制剂，它是从链霉菌属的发酵液中分离出来的，主要通过抑制真菌细胞壁专有的几丁质合成酶 ，干扰几丁质的合成，导致细胞壁缺失，引起真菌细胞的膨胀和破裂，最终造成真菌的死亡。其治疗小鼠芽生菌病的活性为伊曲康唑的3倍，而且毒副作用小，目前国外一直在研究开发半合成和全合成的衍生物。直到现在，几丁质合成酶抑制剂类药物还没有应用到临床［10］。

2.2 延长因子

真菌和哺乳动物细胞的蛋白合成都要需要两个水溶性的蛋白因子:延长因子EF-1和EF-2，它们在mRNA核糖体解码和多肽合成中起重要作用，是蛋白质合成所必需的，并且真菌和哺乳动物细胞中的EF1和EF2结构差异很大，因此，EF是抗真菌药物设计中的重要靶点。目前已经研发出的粪壳菌素 (sordarin)及其衍生物是选择性的EF2抑制剂，作用于蛋白质的翻译过程，对念珠菌和新型隐球菌的抑制效果较好，但抗菌谱较窄。目前还发现了3种新型粪壳菌素(sordarin)及其衍生物:GM2211676、GM2237354和GM2193663，它们在小鼠网状内皮细胞真菌模型中有很好的体外抑制活性。

研究还发现在真菌细胞中合成蛋白时除了上述两个因子外还需EF-3，EF-3为真菌所特有，不存在于哺乳动物细胞中。目前对EF3抑制剂的研究相对较少，至今还没有发现选择性作用于EF3的化合物，由于EF3为真菌所特有，这提示选择性EF3抑制剂可能是一类很有潜力的广谱抗真菌药物。

2.3 双组分信号转导系统蛋白

双组分转导系统是由Ninfa和Magasanik等在20世纪80年代首次在大肠杆菌中发现的。双组份信号转导系统存在于包括真菌在内的大部分低等真核生物，原核生物及植物中，但在哺乳动物细胞中尚未发现。其作用主要是调节趋化现象、孢子形成、新陈代谢、毒力、细胞分裂及适应环境压力。其机制如下:一个细胞膜的感受器激酶接收到一个刺激信号后，其自动磷酸化一个保守的组氨酸残基，然后该磷酸基被传递到反应调节蛋白接受域一个保守的天冬氨酸残基上，随后活化或抑制反应调节蛋白，最后激活或抑制基因表达。目前研究比较清楚的是白念珠菌的双组份信号转导系统［11］。这些双组分信号转导蛋白在细胞适应高渗透压及氧化刺激、菌丝-孢子形态转换、细胞壁生物合成及以及毒力方面起着重要作用。

双组分信号转导系统是目前研究比较多的热门的药靶。所有的白念珠菌都具有三个杂合组氨酸激酶 (HKs:CaSln1p、CaNik1p和 CaHK1p)，一个含有组氨酸的磷酸转移过渡体(Ypd1p)和两个反应调节蛋白(RRs:CaSsk1p和CaSkn7p)。CaSLN1这类蛋白最典型的代表就是Sln1p蛋白。该基因的产物Sln1p是HOG1 MAPK信号转导途径杂合组氨酸激酶感受器，作用主要是调节细胞适应渗透应激。CaNIK1典型的蛋白是Nik1p，主要与细胞壁的合成有关［12］。CaHK1的典型蛋白为 Chk1p，致病性真菌中，Chk1p迄今仅在白念珠菌中发现。Chk1p与白念珠菌细胞壁的合成和毒力有着很大的关系［13］。Ypd1磷酸转移过渡体是含有6个α-螺旋167个氨基酸的蛋白质，其作用是将组氨酸激酶磷酸化后的磷酸基传递给反应调节蛋白。反应调节蛋白Skn7p作为一个转录因子在与细胞周期的调节和细胞壁合成的调节方面有关［14］。CaSSK1P位于Sln1p-Ypd1p下游，主要在环境适应，毒力以及逃避人中性粒细胞的吞噬等中发挥重要作用［11］。

近年来，通过基因敲除技术，HKs及RR的功能已基本被确定。很多研究表明在一个血源播散性感染的小鼠模型中，被敲除了sln1、chk1、nik1及ssk1基因的白念珠菌菌株毒性及菌丝形成能力都减弱［13，15］。敲除不同的基因其表型各部相同，目前研究的最多的是Chk1p和Ssk1p。Chk1p敲除株还可引起细胞壁结构的改变、黏附能力以及群体感应性减低。Ssk1敲除株还可出现对氧化应激敏感、黏附能力减弱以及更容易被宿主的中性粒细胞吞噬等表型［16］。此外，Ssk1p和Chk1p基因敲除的白念珠菌对氟康唑和伏立康唑高度敏感 (敏感度增加16～500倍)，因此，这为Ssk1p和Chk1p抑制剂和氟康唑或者伏立康唑联合用药提供了可能［16］。鉴于双组份信号转导系统蛋白的以上特性，今后必将成为一个理想的抗真菌药物的药靶。

2.4 其他靶点

真菌细胞膜特有的的一种鞘磷脂－肌醇磷脂神经酰胺，不存在于哺乳动物中，通过抑制肌醇磷脂神经酰胺的合成，可使细胞膜形成受阻，破坏细胞膜结构，从而导致细胞死亡，因此它也是一个理想药物作用靶点［17］。此外真菌独有的与真菌耐药有关的外排泵蛋白以及真菌的毒力因子等都有望成为一个理想抗真菌药物的药靶。

近年来，新的抗真菌药物的药靶的研究取得了很大的进展，今后随着真菌基因组学，蛋白质组学、生物信息学和结构生物学等学科的发展和互相交叉渗透，以及高通量药物筛选技术的发展，相信在不久的将来，抗真菌药物药靶的研究将会取得更大的突破，生产出高效、安全的广谱抗真菌药物也将指日可待。

［1］ Silveira FP，Husain S.Fungal Infections in solid organ transplantation［J］.Med Mycol，2007，45(4):305-320.

［2］ Richardson MD.Changing patterns and trends in systemic fungal infections［J］.J Antimicrob Chemother，2005，56(Suppl1):5-11.

［3］ Rogers JF，Nafziger AN，Jr Bertino JS.Pharmacogenetics affects dosing，efficacy，and toxicity of cytochrome P450-metabolized drugs［J］.Am J Med，2002，113(15):746-750.

［4］ Sangamwar AT，Deshpande UD，Pekamwar SS.Antifungals:need to search for a new molecular target［J］.Indian J Pharm Sci，2008，70(4):423-430.

［5］ Duo M，Zhang M，Luk YY，et al.Inhibition of Candida albicans growth by brominated furanones［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2010，85(5):1551-1563.

［6］ Chauhan N，Calderone R.Two-component signal transduction proteins as potential drug targets in medically important fungi［J］.Infect Immun，2008，76(11):4795-4803.

［7］ Akins RA.An update on antifungal targets and mechanisms of resistance in Candida albicans［J］.Med Mycol，2005，43(4):285-318.

［8］ Pasqualotto AC，Denning DW.New and emerging treatments for fungal infections［J］.JAntimicrob Chemother，2008，61(Suppl1):19-30.

［9］ Fera MT，La Camera E，De Sarro A.New triazoles and echinocandins:mode of action，in vitro activity and mechanisms of resistance［J］.Expert Rev Anti Infect Ther，2009，7(8):981-998.

［10］ Gastebois A，Clavaud C，Aimanianda V，et al.Aspergillus fumigatus:cell wall polysaccharides，their biosynthesis and organization［J］.Future Microbiology，2009，4(5):583-595.

［11］ Kruppa M，Calderone R.Two-component signal transduction in human fungal pathogens［J］.FEMS Yeast Res，2006，6(2):149-159.

［12］ Kruppa M，Jabra-Rizk M，Meiller T，et al.The histidine kinases of Candida albicans:regulation of cell wall mannan biosynthesis［J］.FEMSYeast Res，2004，4(5):409-416.

［13］ Kruppa M，Goins T，Cutler JE，et al.The role of the Candida albicans histidine kinase(CHK1)gene in the regulation of cell wall mannan and glucan biosynthesis［J］.FEMS Yeast Res，2003，3:289-299.

［14］ Hohmann S.Osmotic stress signaling and osmoadaptation in yeasts［J］.Microbiol Mol Biol Rew，2002，66(2):300-372.

［15］ Kruppa M，Krom BP，Chauhan N，et al.The histidine kinase Chk1p regulates quorum sensing in Candida albicans［J］.Eukaryot Cell，2004，3(4):1062-1065.

［16］ Du C，Calderone R，Richert J，et al.Deletion of the SSK1 response regulator gene in Candida albicans contributes to enhanced killing by human polymorphonuclear neutrophils［J］.Infect Immun，2005，73(2):865-871.

［17］ Sugimoto Y，Sakoh H ，Yamada K.IPC synthase as a useful target for anti fungal drugs［J］ .Curr Drug Targets Infect Disord，2004，4(12):311-322.