明胶酶与核因子-кB对大鼠心肌纤维化的作用及替米沙坦、氨氯地平的干预效果

商 卓，刘 丽，王 文，马丽媛，孟宪敏

0 引 言

高血压可导致心肌纤维化，表现为细胞外胶原的沉积［1-2］，进而使心脏顺应性下降，冠状动脉血流储备减少，加重心肌缺血，引起心血管不良事件。在心肌纤维化过程中，MMP起重要作用，其中属明胶酶类的MMP-2和MMP-9与心肌纤维化的关系更为密切。抑制NF-кB可缓解动脉缩窄大鼠心肌肥厚的作用［3］。在活体动物模型中通过药物早期预防心肌纤维化，探讨明胶酶和NF-кB在该过程中作用的研究报道较少。文中在已成功建立的AAC大鼠高血压心肌肥厚模型［4］的基础上，早期应用替米沙坦和苯磺酸氨氯地平进行治疗，观察CVF的变化，测定Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量，明胶酶活性及MMP-2、MMP-9和NF-кB蛋白含量，探讨上述药物预防心肌纤维化的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型及分组SPF级8周龄雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，体重200g～260g，由中国医学科学院实验动物研究所提供［合格证号:SCXK(京)2002～2003］。实验获得阜外医院伦理委员会许可。大鼠5只/笼，在恒温(22～24℃)、恒湿(60%)，12h明暗交替环境中饲养，自由进食饮水。购入并适应环境4d后，随机行AAC术。假手术组开腹后只挂线，不结扎，其他程序均与手术组相同。在成功的假手术组模型大鼠中随机选取8只，在成功的AAC模型大鼠中随机选取24只，分为3组:替米沙坦组(n=8)、氨氯地平组(n=8)和AAC对照组(n=8)。替米沙坦和氨氯地平组给药剂量均为5mg(kg·d)，由东瑞制药公司提供原药粉剂，用蒸馏水配制为1mg/ml，每天上午9～10时灌胃给药，每周测体重后调整给药剂量，药物治疗组连续给药8周。AAC组及假手术组正常进食饮水。

1.2 组织样品制备药物治疗8周后，注射1%戊巴比妥(50mg/kg)深度麻醉后横断处死大鼠。迅速分离心脏用预冷等渗盐水清洗，分离左心室，滤纸吸干后称重，部分置10%中性福尔马林液中固定供组织染色。其余心室组织置-70℃保存待测。

1.3 心肌胶原容积分数及含量的测定采用苦味酸天狼猩红偏振光法对胶原进行特殊染色后，胶原在直接光下呈红色，Ⅰ型胶原在偏振光下呈强双折射性黄或红色的粗纤维，Ⅲ型胶原呈弱双折射性绿色的细纤维。用Image Pro Plus 6.0软件进行图像分析，每个标本选一个切片，任取5个视野中所有心肌胶原(不包括血管周围胶原)面积之和，除以全视野面积，得出CVF。同时在偏振光视野下测定其Ⅰ型和Ⅲ型胶原IOD值作为胶原含量。

1.4 明胶酶活性测定冰冻心脏加入适量匀浆液研磨，12000×g离心10 min低温离心后取上清液，用BCA法测定蛋白浓度。用明胶酶谱电泳法分析测定MMP-2、MMP-9活性，试剂盒购自上海杰美基因医药有限公司，严格依照说明书操作。用凝胶成像系统(BIO-RAD)分析各电泳条带的吸光度值(A)。

1.5 MMP-2、MMP-9、NF-кB蛋白含量测定用免疫印迹法进行。制备10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，加入蛋白样品后电泳并转膜，再经封闭、一抗、二抗温育，漂洗后加入超敏电化学发光(eletrochemiluminescence，ECL)发光液显影。用凝胶成像系统分析各转印条带A值，计算与内参照β-actin的比值作为半定量结果。

1.6 统计学分析用SAS9.13软件进行。数值变量应用均数±标准差(±s)表示。多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。如不能满足方差分析条件，则采用Kruskal-Wallis秩和检验。以P≤0.05为差异有显著性统计学意义。

2 结 果

2.1 心肌CVF和Ⅰ型、Ⅲ型胶原IOD值心肌CVF在假手术组、替米沙坦组、氨氯地平组和对照组中均呈上升趋势，各组间差异有统计学意义(P＜0.05)。Ⅰ型胶原IOD值和Ⅰ型胶原/Ⅲ型胶原比值也呈上升趋势，各组间差异有统计学意义(P＜0.05)。Ⅲ型胶原IOD值虽呈上升趋势，但在替米沙坦组和氨氯地平组之间无统计学差异，见表1。

表1 各组大鼠心肌CVF，Ⅰ、Ⅲ型胶原IOD值，Ⅰ型/Ⅲ型胶原比值(±s)Table 1 M yocardial CVF，IOD values of type-Ⅰ，-Ⅲand-Ⅰ/Ⅲin different groups of rats(±s)

表1 各组大鼠心肌CVF，Ⅰ、Ⅲ型胶原IOD值，Ⅰ型/Ⅲ型胶原比值(±s)Table 1 M yocardial CVF，IOD values of type-Ⅰ，-Ⅲand-Ⅰ/Ⅲin different groups of rats(±s)

与AAC对照组比较，*P＜0.05;与假手术组比较，#P＜0.05;与氨氯地平组比较，△P＜0.05

组 别 n CVF(%) Ⅰ型胶原(IOD/μm2) Ⅲ型胶原(IOD/μm2) Ⅰ型/Ⅲ型胶原比值AAC对照组 8 11.48±0.46 9753.5±456.63 922.75±54.51 10.59±0.56假手术组 8 2.50±0.19* 1656.85±51.93* 382.96±21.43* 4.34±0.36*氨氯地平组 8 6.32±0.25*# 5236.48±352.32*# 710.03±22.20*# 7.38±0.51*#替米沙坦组 8 4.55±0.21*#△ 3830.5±153.11*#△ 694.58±6.60*# 5.51±0.17*#△

2.2 明胶酶活性心肌组织中MMP-2活性在替米沙坦组和氨氯地平组之间差异无统计学意义，低于AAC对照组(P＜0.05)，高于假手术组(P＜0.05)。MMP-9活性在假手术组、替米沙坦组、氨氯地平组和AAC对照组中依次增加，各组间差异有统计学意义(P＜0.05)，见图1。

图1 各组大鼠心肌明胶酶活性Figure 1 Activity of gelatinases in different groups

2.3 MMP-2、MMP-9、NF-кB蛋白含量心肌组织中MMP-2和MMP-9含量在假手术组、替米沙坦组、氨氯地平组和AAC对照组中依次增加，各组间差异有统计学意义(P＜0.05)。NF-кB含量在假手术组、替米沙坦组、氨氯地平组和AAC对照组中也呈上升趋势，但假手术组和替米沙坦组之间差异无统计学意义，蛋白含量低于AAC对照组(P＜0.05);氨氯地平组和AAC对照组之间差异无统计学意义，蛋白含量高于假手术组(P＜0.05);替米沙坦组低于氨氯地平组(P＜0.05)，见图2。

图2 各组大鼠心肌MMP-2、MMP-9与NF-кB蛋白含量Figure 2 Protein levels of gelatinases and NF-kB in different groups

3 讨 论

AAC术后引起持续性心脏压力超负荷，最终导致心肌纤维化。本研究中AAC对照组心肌胶原各组分含量均明显高于假手术组，还发现替米沙坦和苯磺酸氨氯地平均可抑制心肌胶原组分增生，预防心肌纤维化，替米沙坦的作用比苯磺酸氨氯地平更强。业已证实，肾素血管紧张素系统(resin-angiotensin system，RAS)在心肌纤维化过程中起重要作用，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是RAS中的主要活性介质。替米沙坦是新一代长效非肽类选择性血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂，除具有降低压力负荷预防心肌纤维化的作用外，还可特异性与AT1受体结合，减少AngⅡ通过AT1受体介导引起的心肌纤维化作用，同时反馈性增加AngⅡ与AT2受体的结合，发挥保护心脏的作用［5］。而苯磺酸氨氯地平是长效降压药，也具有改善心肌肥厚的作用［6］，主要通过降低心脏压力负荷、改善心肌供血而抑制心肌纤维化的形成。但钙通道阻滞剂有增加心率的作用，可能会抵消部分对心脏有益的效应，因此苯磺酸氨氯地平抑制心肌纤维化的作用相对较弱，但与AAC对照组比较，仍可明显抑制各心肌胶原组分的生长。

在本研究中随着明胶酶活性和含量增加，心肌胶原成分增多。应用药物干预抑制明胶酶后，心肌胶原成分减少。替米沙坦和苯磺酸氨氯地平两药均可抑制明胶酶而抑制胶原降解及聚集，预防心肌纤维化。以往研究报道多注重于明胶酶活性对心肌纤维化转变的作用，但由于明胶酶测量时间窗不同，尚不清楚MMP-2和MMP-9在心肌纤维化过程中所起的关键作用［7］。已知高血压患者血清明胶酶组分含量增加［8］。本研究发现MMP-2和MMP-9均在心肌纤维化过程中起作用。Sakata等［7］发现，MMP-2和MMP-9mRNA水平增加时心肌纤维化面积增大;药物干预后MMP-2和MMP-9水平减低，心肌纤维化面积缩小。本研究结果与上述报道结论相符。本研究观察到左心室MMP-2蛋白表达水平与其酶活性变化并不同步，提示可能存在非酶解激活途径。

2药物组对明胶酶的抑制程度并不相同，替米沙坦组的抑制作用更强，这可能是替米沙坦具有较强的预防心肌纤维化作用的原因之一。为进一步探讨药物干预预防心肌纤维化的机制，我们测量了心肌组织中NF-кB蛋白含量。以往研究发现，心肌肥厚的形成与NF-кB活化有关［3］，抑制NF-кB可减轻心肌肥厚［9］。我们的研究也证实心肌纤维化程度最高的AAC对照组大鼠心肌中NF-кB含量最高。通过药物治疗后NF-кB含量减少，心肌纤维化程度也随之减轻。而且各组大鼠心肌明胶酶的活性和含量的变化趋势也与NF-кB含量的变化一致。Esteve等［10］发现，NF-кB与MMP的表达密切相关，对心肌组织重构也具有重要作用［11］。在肌肉组织中，MMP-2和MMP-9是NF-кB的目标基因［12］。Xie等［13］发现，在大鼠成纤维细胞中，NF-кB的活化促进MMP-2和MMP-9的表达和活化。MMP-9分子上存在NF-кB的结合位点，而NF-кB可能通过与其他转录因子相互作用实现对MMP-2的调节作用［13］。2种药物干预都不同程度降低了NF-кB含量，但替米沙坦的作用较强，提示替米沙坦抑制心肌纤维化的作用可能是通过减少NF-кB的生成而抑制MMP-2、MMP-9的活性与合成而实现的。

总之，替米沙坦、苯磺酸氨氯地平可抑制明胶酶而预防心肌纤维化，NF-кB参与了替米沙坦抑制明胶酶的过程。但NF-кB抑制明胶酶的途径以及药物干预是防止心肌纤维化的发生还是仅仅延缓其进程尚有待进一步研究。

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