基于RNA干扰原理抗病毒转基因作物的应用及安全性

王新朵， 李 莉， 王锡锋

（植物病虫害生物学国家重点实验室，中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193）

近年来我国主要农作物病毒病发生的种类和面积不断增加，给农业生产造成了巨大损失。植物病毒是植物的活体寄生物，病毒病害素有“植物癌症”之称。对多数病毒病而言，以农药为基础的常规防治方法无法从根本上解决问题［1］。因此，控制病毒病最为经济有效的途径是利用品种自身抗性达到主动防治的目的。然而传统的育种方法由于缺乏理想的抗源，抗病基因又多与劣质基因相伴随，获得抗病、高产优质双重特性品种的难度很大，很难在短时间内取得突破，寻找有效的方法培育抗病、优质高产的作物新品系是当务之急。

自从1983年转基因植物诞生以来，植物转基因工程发展势头始终不减，现已跃入大规模商业化生产阶段，并成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。因此利用转基因技术创制免疫或高抗作物病毒病的新品系（品种）是解决严重威胁我国农作物病毒病害的有效策略之一。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）则是近年来发现的一种重要基因沉默现象，它是通过双链RNA介导的特异性降解对应序列的mRNA，从而抑制相应基因的表达，是植物在长期进化过程中形成的对外来入侵者的一种重要的防御机制。RNAi普遍存在于各种生物，且在动物、植物和真菌中都证实了其具有特异性、稳定性、高效性、不改变原有基因组遗传组成及转基因后不在植物体内表达蛋白质等优点，其在植物遗传改良，尤其是抗病毒育种等方面有着广阔的应用前景。

1 RNAi的作用机制及其在转基因作物的应用原理

1．1 RNAi的发现和作用机制模式

RNAi现象是1990年Jor gensen［2］等在转基因植株中首先发现的，当时这种同时抑制自身和相应内源基因表达的基因沉默现象被称为基因的共抑制（co－suppression）。随后诸多的研究报告了共抑制现象都是由核基因转录后形成的mRNA降解引起的［3］，确定为转录后基因沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）。直到1998年，Fire等发现将双链RNA（ds RNA）注入秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）可以引起特异性基因沉默，并将这一现象定义为RNA干扰。后来证明除了外源ds RNA引发RNAi外，内源性ds RNA存在同样的机制［4］。

在不同的生物体内，不同的ds RNA引发的RNAi的详细过程不尽相同，但RNAi有共同的作用模式。RNAi对基因表达的调节效应最终通过3种方式发生作用：1）靶mRNA的降解；2）阻止mRNA的翻译过程；3）RNA指导的DNA甲基化（RNA－directed DNA met hylation，Rd DM）。前两种属于PTGS，最后一种属于TGS（transcriptional gene silencing）。其中以mi RNA通路发生的PTGS是RNAi最核心的沉默机制。在植物体内，RNAi作用过程基本概括为：1）细胞核内ds RNA的形成，包括由正义mRNA和反义mRNA结合成的ds RNA，由单条RNA回折互补形成的hp RNA（haipin－RNA）等；2）属于RNaseⅢ类的Dicer或DCL（Dicer－like）识别 ds RNA 并进行切割，产生5′－磷酸基团，3′－OH 并突出2 nt的si RNA（s mall－interfering RNA）的双链体，此双链体解离后转出细胞核［5］；3）si RNA或mi RNA与 AGO（Argonaute）等蛋白结合形 成 RISC（RNA－induced silencing co mplex），RISC寻找与自身复合体中的si RNA或mi RNA碱基配对的mRNA结合；4）RISC将mRNA切割成小片段，有时在不将mRNA切断的情况下通过si RNA或Ar gonaute蛋白特异性阻止mRNA的翻译［6］；5）释放的si RNA以自身为引物，以mRNA为模板，在 Rd Rp（RNA－dependent RNA pol y merase）的作用下合成新的ds RNA；6）si RNA分子可以通过胞间连丝或韧皮部运输实现细胞、组织间的传递［7］。

除了mi RNA通路，拟南芥体内还存在tasi RNA通路，nat－si RNA通路，rasi RNA通路。其中rasi RNA通路可以引发Rd DM，属于TGS。

1．2 RNAi是一个广泛存在的自然现象

已有研究表明，内源性mi RNA也可以介导RNAi。在高等生物中，存在200种以上的miRNA，约占基因组的1%［8］。每个细胞中，可能存在几百到上万个这样的分子［9］。在拟南芥中已发现了几百种不同的siRNA［10］。细胞核中转录的原初mi RNA（pri mary－mi RNA）在ds RNA 结合蛋白（ds RBP）的参与下被DCL1切割成双链体miRNA，双链体miRNA被甲基转移酶HEN1在3′甲基化修饰后在核输出蛋白 HST（HASTY）的帮助下进入细胞质［11－13］。在胞质中，成熟的单链miRNA装载AGO1后形成RISC，RISC靶向切割同源配对的mRNA。植物中mi RNA的RNAi途径主要由靶mRNA的降解导致靶基因的低表达，哺乳动物或昆虫却主要依赖mi RNA靶向mRNA的3′的UTR区互补配对从而影响mRNA的正常翻译［14］。

自然界广泛存在的RNAi现象解决了人们对RNAi技术的伦理学疑惑，极大地鼓舞了siRNA药物和RNAi转基因作物的开发应用。目前，国际上已有几个siRNA治疗药物被批准进入临床试验［15］，RNAi技术在抗病毒转基因作物中的应用也已成为研究的热点。

2 RNAi技术在抗病毒转基因作物研究中的应用

抗病品种的培育、推广是控制作物病毒病最为经济有效的途径。RNAi被认为是一种古老的植物抗病毒机制［16－19］，是用来防止外来遗传物质干扰自身基因组功能和稳定性的重要机制，是生物体中一种不完全的原始生物免疫系统。病毒侵染植物时，当病毒核酸的复制数量达到强烈干扰植物基因组正常生理生化功能时，植物会通过甲基化修饰或激活特异性RNA降解系统来专一性降解病毒RNA，从而抑制病毒复 制［20］。自 从 1986 年 Powell－Abel等［21］首次获得抗烟草花叶病毒（T MV）侵染的转基因烟草以来，很多研究人员开始将病毒的不同基因（如复制酶基因、运转蛋白基因、外壳蛋白基因等）序列导入植物，强化植物体天然的抗病毒机制，均获得抗病毒植株。

1999年Pinto等［22］将南方菜豆花叶病毒属的水稻黄斑驳病毒（Rice yellow mottle virus，RYMV）复制所需酶的部分基因通过构建载体而转化水稻，诱发基因沉默，从而使植物具有RY MV的抗性，且这种抗性能稳定遗传3代。2000年 Wang等［23］利用大麦黄矮病毒（Barley yellow d war f vir us，BYDV）PAV的复制酶基因片断的反向重复序列载体（hp BYDVpol）转化大麦，获得对PAV免疫的植株。2001年Tenllado等［24－25］分别以直接注射和农杆菌介导转化两种方式将病毒复制酶基因部分序列构建ds RNA导入植物叶片细胞，结果发现两种方式都可成功阻止辣椒轻型斑驳病毒（Peppermild mottle virus，PMMo V）、烟草蚀斑病毒 （Tobacco etch vir us，TEV）和苜蓿花叶病毒（Alfalfa mosaicvirus，A MV）3种病毒的侵染过程。2002年Kalantids等［26］将黄瓜花叶病毒（Cucu mber mosaic virus，CMV）部分基因的c DNA反向重复序列导入烟草中，并且检测到一个完全抗CMV的株系。2004年Ma等［27］根据抗水稻矮缩病毒（Ricedwar fvirus，RDV）序列，构建了与其相关的RNA干扰序列，导入水稻中，发现对水稻矮缩病毒有很高的抗性。2005年Andika等［28］证实RNAi诱导的抗甜菜坏死黄脉病毒（Beet necrotic yellow vein virus，BNYVV）在叶中比根部有效。2006年Shuichiro Takahashi等［29］分别以马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）的外壳蛋白基因和编码RNA沉默抑制因子的TGBp1基因为靶位点来设计si RNA，结果显示这两种si RNA都能干扰PVX的侵染。2007年代玉华等［30］对水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）的CP基因，设计了ds RNA，构建干涉载体，遗传转化水稻，获得了能稳定遗传、高抗或免疫的植株。2011年Taku mi等［31］将RSV编码的7个基因都构建成干涉载体，分别导入水稻受体，接种试验表明：转CP、SP基因的水稻对接种免疫，转p C1基因的水稻抗病性显著提高，转p C2和p C4基因的水稻抗病性没有增加。

众多成功的事例说明，利用RNAi技术以工程化的手段赋予植物体病毒抗性具有高度可行性，有可能成为植物抗病毒基因工程研究中的一种特异抗性手段［32］。20世纪80年代末，美国 Monsanto、Cal gene、Du Pont等公司即开始进行RNAi转基因抗病毒作物的研究开发，并在90年代末获批释放了第1批转基因作物，如转病毒CP基因抗马铃薯卷叶病毒（Potato leaf roll virus，PLRV）、马铃薯 Y病毒（Potato virus Y，PVY）的马铃薯等［33］。

3 RNAi介导的抗病毒转基因作物的安全性

3．1 食用安全性

3．1．1 过敏原

人们可能认为基因改造食品潜在危险来自于基因转化过程本身，故认为基因食品是有害的。然而，天然食品不等于安全食品，没有零风险的食品，如小麦粉、谷子、花生、大豆、杏、板栗、腰果、鱼、虾、蟹、龙虾、鸡蛋、牛奶等对不同的人来说，都可能成为过敏原，一般的蔬果也可能含有致癌物，而特定的食品在经过不同的搭配混合后，一样会产生毒素。应用RNAi策略对作物抗病毒特性的遗传改造，导入的外源基因本身就是寄生于作物的病毒基因，且以双链发夹结构存在，通过特异性降解病毒基因而达到抗病毒的目的，在转基因植株内不会表达外源蛋白，对应的抗病毒转基因作物的营养成分与原作物没有差异，故转基因植物不会增加过敏蛋白，不会引入新的过敏原。牛颜冰［34］对表达 CMV2ΔRep或 To MV2 MP ds RNA的转基因烟草植株进行Northernblot分析已经证明了这种结论。根据实质等同原则如果一种新食品或食品成分与已存在的食品或食品成分实质等同，能够被认为与传统食品或食品成分一样安全［35］。因此，通过该机制所产生的抗病毒转基因植物可以符合人们对生物安全性的高要求。

3．1．2 残留的ds RNA

RNAi转基因作物通常通过dsRNA介导靶基因沉默，所以残留dsRNA可能存在风险。目前，临床研究表明口服ds RNA对哺乳动物不会产生影响［36］。这是因为ds RNA不会在哺乳动物细胞间传递或者是很快地被降解。因为哺乳动物细胞间信号传递机制要比植物、线虫、昆虫复杂得多，而且ds RNA通过人的胃和肠道时会被其中的酶和菌群降解。哺乳动物中缺乏依赖于RNA的RNA聚合酶（Rd Rp），不存在放大级联反应。Irie［37］等人发现，在低等生物中RNAi可持续存在，但RNAi在哺乳动物细胞中只能维持一段时间。一般注入ds RNA后的2～3 d，RNAi的作用最明显，而后1～2 d内，靶mRNA的丰度就能恢复到注射RNAi之前的水平。

除了口服dsRNA不会对哺乳动物产生影响外，Gil等［38］的研究表明，dsRNA大于30 bp在哺乳动物细胞中不会引起RNAi现象，因为较长的ds RNA在哺乳动物细胞中能诱导干扰素生成，导致非特异性的蛋白质合成障碍；另一方面，dsRNA又能诱导细胞产生多种抗病毒蛋白的酶，发生非特异性的RNA降解效应。而Sabine［39］研究表明引发有效RNAi的ds RNA最短不得短于21 nt，Dicer能与200～500 nt范围内的ds RNA结合，底物片段越短，Dicer酶的活性也就越弱。因此，如果既使ds RNA发挥作用又不使其对哺乳动物造成危害，要控制好ds RNA的长度。而目前在转基因作物中应用的ds RNA长度一般大于30 bp。这些都表明摄食转ds RNA的食物不会对哺乳动物产生影响。

3．1．3 siRNA 水平

RNAi通过si RNA发挥作用。除了dsRNA策略的RNAi，在转基因作物研究中有的直接导入si RNA。短于30 bp的si RNA，不会促发干扰素效应，能特异性地降解mRNA，引起哺乳动物细胞的基因沉默。近来在药物研究领域发现，si RNA分子在哺乳动物体内会产生脱靶效应［40］，因此，对于siRNA在转基因作物中的残留是否对哺乳动物产生影响是最值得关心的问题。

然而siRNA在环境中不稳定，且RNAi机制本身就是植物自然存在的一种古老机制，多年来也未曾发现对哺乳动物造成负面影响。siRNA的药物研究表明，siRNA在体内处于极不稳定状态。这主要是因为其相对分子质量小（约为7 000），容易被肾透析并很快清除，也容易被内源性的血浆RNA酶降解，在血浆内半衰期为5～60 min［41］。

对于siRNA发挥沉默作用，其剂量问题是不容忽视的。唐省三等［42］在研究中发现si RNA对病毒性心肌炎疗效的影响是剂量依赖性的，随注射si RNA剂量增加，病理变化逐渐减轻。在转基因食品烹饪和加工过程中si RNA易降解，在体内易降解，因此残留的si RNA剂量远远小于药物的剂量。因此，基于RNAi作用获得的转基因食品对哺乳动物的影响应该是微不足道的。但是为了进一步确保安全，应该对每一种RNAi转基因作物产品进行si RNA含量的测定。

3．2 环境安全性

抗病毒转基因作物除了考虑到哺乳动物（包括人）的安全性外，还要考虑到对其他非靶标生物的影响，对生态环境的作用，及插入的外源基因是否会与病毒的核酸发生重组而产生新病毒等问题。

RNAi对靶基因的沉默是高度特异性的，一般来说，当si RNA有4个或以上碱基不配对时，RISC将无法识别该mRNA，一个碱基的突变甚至也会对干扰的效果产生巨大的影响［43］。所以RNAi的转基因作物对非靶标生物的影响很小［44］。到目前为止，在获得释放的美国3个转CP基因作物南瓜、番木瓜和李中，并没有发现任何的过敏原［45］。表达李痘疱病毒（Plumpox virus，PPV）CP基因的李树与非转基因的相比，节肢动物及传毒蚜虫的种类和数量没有差异［46］。对抗番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）的番木瓜的研究表明，土壤各层的放线菌多样性和总量没有受到显著影响［47］。虽然还没有发现RNAi对非靶标生物的影响，但基于非靶标生物可能存在靶基因的同源序列，脱靶效应将成为基于RNAi技术转基因作物安全性评价的关键问题［48］。

3．2．1 RNAi介导的抗病毒作物不存在重组风险

在自然环境下，植物病毒间的重组已在苜蓿花叶病毒属（Al famovirus）、雀麦花叶病毒属（Bromovir us）和番茄丛矮病毒科（To mbusviridae）中发现［49］。某些野生的植物病毒通过重组从转基因植物中截获一定的病毒基因也已被证明。如Borja等［50］发现，番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）CP突变体和转基因CP之间由于发生了重组而导致野生型病毒的再生。Falk等［49］认为，转基因植株中的RNA与野生病毒RNA基因组之间重组率很低，即便是发生了重组，新的重组病毒在整个病毒侵染周期的一系列过程中，也不会有更高的生活力［51］。然而采用RNAi介导的抗性策略能够有效地避免重组发生。因为RNAi介导的抗病毒转基因作物主要是通过将病毒基因组上的基因构建成ds RNA，将导入的基因与其同源的入侵RNA都降解成21～26 nt的干扰型 RNA（si RNA）［52］。通过这种方法所获得的抗病毒植株在转化的细胞质中有少量或者没有转基因mRNA积累［53］，由于缺少重组所需的必要模板，所以不会发生重组。

3．2．2 脱靶效应及对非靶标生物的影响

脱靶效应是指由siRNA引起的、通过RNAi机制作用于非靶mRNA导致非靶基因沉默的现象。当siRNA分子的中间有一个碱基与mRNA不配对时，RISC仍具有识别该mRNA的能力。这使得si RNA能够介导序列相似的非靶mRNA的降解从而导致非靶基因的沉默［43］。目前已知脱靶效应在mRNA水平和蛋白质表达水平上都能够检测出来［54］。

Fedorov等发现一段随机选择的siRNA可以通过完整的RNAi通路实现细胞存活率的改变，但这一毒性不依赖于靶基因的沉默，si RNA诱导的脱靶效应产生了可观测到的表型［55］。Xing等在拟南芥中同样发现RNAi可以产生非预期的花粉活力下降的表型［56］。所以在开发RNAi转基因作物时，最为关键的问题就是要进行高效特异的si RNA序列设计和化学修饰，可以既保持或增强靶基因的特异性沉默效果，又避免si RNA诱导脱靶作用。传统的BLAST来搜索脱靶基因会忽略很多候选的脱靶基因，而通过计算生物学方法能够在精度和成本之间得到平衡，可以迅速找出候选的脱靶基因［57］。目前网上许多脱靶评估软件，如ds Check不仅能对si RNA脱靶可能性进行精确的软件搜索验证，而且提供最小化脱靶效应ds RNA的设计［58］。

3．2．3 siRNA残留对非靶标生物的影响

在考虑siRNA对非靶标生物的影响时，必须要强调的是siRNA的剂量是否足以引起脱靶效应。由于si RNA的目的基因的沉默效率和脱靶效应几率都与siRNA的浓度呈正相关，因此为了避免高剂量的siRNA引起的脱靶效应，在转基因育种中可以优化si RNA池（siRNA pool），即通过同时严格设计几条特异位点的siRNA，挑选最有效的siRNA最佳混合比例。这样靶向同一mRNA的不同siRNA的单独浓度降低了，降低了脱靶效应几率，而混合的siRNA的沉默效率却是几条siRNA的加和甚至更高，因此沉默效率不会下降，实现了目的基因沉默的效率最大化和最小的脱靶效应发生的可能性。

4 讨论和展望

从本质上讲，转基因作物和常规遗传育种育成的品种都是在原有品种的基础上对部分性状进行修饰。传统的育种方法是以基因突变和有性杂交为基础，限于自然界中自发的基因重组和交换，而转基因作物育种是人为地将某些生物的基因转移到作物的遗传物质中去，使其在产量、抗性、营养品质、消费品质等方面向人们所需要的方向转变。基因重组技术缩短了新基因产生的时间，打破了生物种之间的基因交流界限。因此，人们担心转基因作物的应用会产生一些食品和生态安全风险。但是，可能的风险不等于真实的风险。随着转基因作物的应用，各国都将转基因作物安全评估纳入到转基因作物的监管中［59］，分为食品营养安全风险评估和生态安全风险评估。风险评估过程是一个从建立问题也称危害性识别，到最后给出风险结论的过程，由危害性识别、暴露评估、效果测试、风险描述等几部分组成［60］。因为不存在绝对的安全性和零风险，转基因作物风险评估的第1步就是要求对转基因作物的潜在危害做合理假定，在此过程中要毫不犹豫地忽略无关紧要的假定危害而保留重大的问题并做进一步的细化考虑［61］。在转基因作物的安全评价方面，国际上已经广泛接受和采用实质等同原则和个案分析原则。

作为生物界普遍存在的机制之一，RNAi技术已在全球范围迅速发展，其优势有目共睹。RNAi介导的抗病毒转基因植株具有高效、特异性抗性，且不会翻译成有功能的病毒蛋白质，不存在病毒RNA重组、异源包装及协生作用的潜在生物风险，具有较高的生物安全性。虽然RNAi介导的抗病毒转基因作物也潜在一些风险，如对非靶标生物的影响，但是随着对RNAi机制的不断深入了解，通过RNAi技术的日臻完善，及构建严密的、科学的、合理的生态风险评估系统，对转基因植物的商业化大面积释放所存在的潜在生态学影响进行长期的监测监控研究，将为RNAi更加安全有效地应用于转基因作物开辟更广阔的前景。

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