脑血管病与神经元凋亡

刘利宁 王满侠

(兰州大学第二临床医学院，甘肃 兰州 730030)

不同类型脑血管病 (CVD)都存在局灶性或全脑缺血，细胞凋亡是脑缺血周边区神经细胞死亡的主要形式。由于该过程在一定条件下具有可逆性，寻求细胞凋亡与血液循环障碍相关器官、组织和细胞缺血性损伤之间的因果关系及其可能的病理生理机制，利用抗凋亡治疗减轻缺血造成的损伤，一直是近年来生物医学研究普遍关注的热点。本文就CVD中常见的缺血性脑梗死 (IS)、脑出血 (ICH)以及蛛网膜下腔出血 (SAH)与神经元凋亡有关的问题及抗神经元凋亡治疗的现状进行综述。

1 脑缺血损伤与神经元凋亡

传统观点认为，缺血性神经元死亡仅表现为细胞坏死，而非细胞凋亡。神经元细胞坏死通常认为是由兴奋性氨基酸谷氨酸或天冬氨酸介导的，但是近年来证据表明，兴奋性氨基酸也广泛介导了细胞凋亡过程，利用谷氨酸受体拮抗剂可显著减轻神经元凋亡〔1〕。1977年Astrup等在狒狒脑缺血实验中首次发现缺血半暗带(Ischemic Penumbra)，并认为缺血半暗带中缺血神经元达到了电衰竭、能量代谢离子泵功能衰竭的阈值。Endres〔2〕通过总结多个动物实验证据后指出神经元凋亡是缺血性半暗带梗死的主要形式，而凋亡抑制剂有望用于治疗急性脑梗死。Linnik等〔3〕于1993年应用放线菌酮(蛋白质合成抑制剂)降低了大鼠模型局灶性脑缺血模型梗死面积，并指出脑缺血后局部神经元过度凋亡是造成再灌注损伤的主要原因之一，也是神经元迟发性死亡的主要形式。研究提示重度长时间缺血引起神经细胞坏死，轻度短时间缺血及再灌注易引起神经细胞发生凋亡〔4，5〕。神经元凋亡是缺血性脑损伤的形式，细胞凋亡加重了缺血再灌注损伤。显然在这些过程中，细胞凋亡和脑缺血损伤可互为因果，无论是ICH还是SAH，局灶性或全脑缺血都是存在的〔6，7〕，因此脑缺血损伤所致的神经元凋亡应该普遍存在于CVD病程中。

2 不同类型CVD与神经元凋亡

2.1 IS与神经元凋亡 IS的病理基础是血管闭塞，而溶栓或血管重建治疗再通血管是理想治疗，但由于血管再通却带来了一系列缺血再灌注损伤。Abe等〔8〕发现短暂全脑缺血再灌注4 d后，海马CA1锥体细胞神经元细胞迟发性死亡，并提出线粒体DNA表达障碍可能导致的线粒体穿梭系统的功能障碍，并可能导致CA1区神经细胞能源生产逐渐衰竭，最终导致细胞死亡。而Du〔9〕则在大鼠颈总动脉及右大脑中动脉闭塞模型中证实严重缺血(90 min)导致典型梗死;30 min的轻度局灶性缺血所致梗死边缘可在3 d后出现典型细胞凋亡表现，1 mg/kg放线菌酮预处理可明显减轻梗死面积，这充分证实了梗死灶周围存在迟发性神经元凋亡。因缺血缺氧，线粒体产生氧自由基增多，再灌注时组织产生自由基也增多，胞浆中Ca2+浓度大量增加。二者均使线粒体膜发生脂质过氧化，使线粒体结构和功能受损，表现为利用氧能力障碍。Fujimura等〔10〕认为活性氧的产生参与缺血再灌注损伤，活性氧还介导线粒体信号通路，可能导致脑缺血后细胞凋亡，并应用过度表达抗氧化剂铜/锌超氧化物歧化酶的转基因小鼠观察到其神经保护作用。在全大脑缺血大鼠模型中，线粒体功能明显下降，大量形成的活性氧可加重神经元损伤，但线粒体摄取钙能力并不显著降低，线粒体通透性改变或凋亡启动可能是神经元损伤的重要机制〔11〕。活性氧可以引起DNA甲基化，导致细胞凋亡和细胞活化死亡有关的基因。活性氧可导致bcl-2过度表达和p53基因敲除小鼠的神经毒性，并诱发天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活化〔12〕。Shen 等〔13〕认为在缺氧缺糖环境下，伴随活性氧的产生和神经细胞钙离子内流，神经元对烟酰胺呈剂量依赖，烟酰胺可减少即早基因c-fos原癌基因和zif268基因表达，减少缺血再灌注大鼠的神经元凋亡而减小梗死面积。

2.2 ICH与神经元凋亡 ICH后局部形成血肿，血肿中心的神经元坏死不可避免，而血肿周围的脑组织由于机械压迫，处于相对缺血状态。ICH后血肿周边继发性损伤是一个复杂的病理生理过程，其具体的损伤机制至今未完全阐明。ICH后的脑损伤是多因素共同作用的综合表现，包括血肿占位效应、神经细胞凋亡和坏死、炎症、血红蛋白毒性等，是否还有其他损伤机制参与及作用过程还有待更为深入的探讨。Nakashima〔14〕应用气囊模型制备的大鼠基底节区ICH模型，6 h后可明显观察到病灶中心原位末端转移酶标记(TUNEL)及Fas抗原阳性细胞，24 h后凋亡细胞数量迅速增加，细胞凋亡可能有助于病灶核心形成，病变却没有进一步扩展。Matsushita〔15〕则应用0.5 U胶原酶注入大鼠纹状体致ICH，24 h后，大量TUNEL阳性的凋亡细胞出现在出血中心和边缘，这些TUNEL阳性细胞主要是神经元和星形胶质细胞。应用可以穿透细胞膜的广谱Caspase抑制剂苄氧羰-缬氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-〔O-甲酰〕-氟甲基酮(zVADfmk)治疗可显著减少TUNEL阳性细胞，而胶原酶等效剂量不诱导体外培养的原代神经元细胞死亡。这些的证据表明，神经元凋亡机制可能调节TCH后的脑损伤。Levy〔16〕将神经母细胞瘤细胞分别置于血红蛋白，球蛋白、原卟啉、血红素和铁中培养后发现:血红蛋白、血红素相对于球蛋白来说是剧毒性的，血红素处理后的细胞出现DNA降解，Caspase活化和线粒体膜电位下降呈现典型的凋亡细胞死亡模式。抗氧化剂L-乙酰-半胱氨酸或铁螯合剂去铁胺可减少血红素诱导的细胞死亡，表明氧化应激在这一有害进程中的作用。因此抗氧化的基础上，应用铁螯合剂等抗凋亡治疗可有效抵制血红蛋白毒性。

2.3 SAH与神经元凋亡 神经元凋亡也存在于SAH。Runnerstam等〔17〕人在兔子弥漫脑损伤伴广泛SAH模型中监测细胞外兴奋性氨基酸、颅内压并观察神经元c-Jun基因表达TUNEL阳性细胞。数小时后海马细胞外谷氨酸，甘氨酸和牛磺酸显著增加，持续24 h以后仍高。24 h后海马和小脑颗粒层出现c-Jun阳性细胞，而大脑皮层却很少检测到。接着出现c-Jun阳性的神经元核周体和海马锥体CA4颗粒层及小脑Purkinje细胞。TUNEL阳性细胞在伤后10 d大量出现，凋亡神经元广泛分布于在大脑皮质，海马和小脑。重度脑损伤所致的脑水肿和神经元的兴奋毒性在1 h内出现，24 h后开始出现更广泛的迟发性神经元凋亡和细胞死亡。Nau〔18〕对20例SAH进行的尸检显示，齿状回神经元细胞凋亡较持续休克或呼吸衰竭致慢性脑缺氧死亡以及非神经系统疾病致死者更常见，死亡于24 h至11 d者，总是出现海马神经元坏死，而非细胞凋亡。脑血管痉挛(CVS)是SAH的重要并发症。SAH后，血液或其裂解物进入蛛网膜下腔，有可能刺激机体产生致炎因子而诱发CVS，而CVS与神经元凋亡机制的关系还不十分清楚。Wang等〔19〕尝试将肝素化红细胞溶解液注入兔子小脑延髓池，对照组注入肝素盐水，处死后切除基底动脉和脑组织切除后固定，观察到SAH组颞叶神经细胞凋亡指数平均为26%，对照组仅0.5%，两组间基底动脉横截面积无差异，故认为SAH神经元凋亡机制可能与CVS无关。

3 CVD抗神经元凋亡治疗现状

神经元具有不可再生的特点，CVD治疗策略主要是将神经元的损害影响降到最低程度，最大限度保留恢复神经功能，减轻致残率。神经元凋亡现象广泛存在于各种CVD病程中，这为人们通过抗凋亡治疗CVD提供了理论依据。同时，神经元凋亡又是一种迟发性病变，在一定条件下具有可逆性，因此寻求有效药物抑制脑缺血后神经元过度凋亡是实现脑保护的一条重要途径。细胞凋亡的途径包括了线粒体途径和死亡受体途径，许多基因、酶、及细胞因子被发现参与了这些过程。通过修饰这些基因及酶类或者寻找细胞因子及其受体的拮抗剂将能有效干预细胞凋亡过程。神经系统由于血-脑屏障的存在，仅能使相对分子量＜600的小分子物质、链长＜6个氨基酸的肽、脂溶性药物能通过血-脑屏障，大多数药物却无法通透而进入脑内，使神经系统疾病的治疗成为难点。血脑屏障的存在使血液循环中的有害物质难以进入脑内，同时也使大多数药物无法穿越而发挥其有效治疗作用，但是一些阳离子多肽:细胞穿膜多肽(CPP)的发现使人们看到了希望。CPP是一类不依赖受体介导而可以直接进入细胞内的多肽，也有研究者称这类短肽为蛋白转导域(PTD)，或特洛伊木马肽(Trojan horse peptide)。实验证明这些多肽分子不但自身能自由进出细胞膜，而且还可以携带其他物质一同进入细胞，在此过程中细胞膜并不受任何损害，所携带的物质在细胞中仍表现正常的活性〔20〕。Donnini等〔21〕人将抗凋亡蛋白 Bcl-X(L)的四氢生物蝶呤(BH4)结构域与反式转录激活因子TAT，一种CPP结合后，对脑栓塞大鼠进行注射，发现TAT-BH4可以减少大鼠神经元和血管内皮细胞凋亡，加速神经干细胞募集，诱导神经元的可塑性。因此有理由相信，随着细胞凋亡机制的进一步阐明及药物技术的完善，具有抗凋亡价值的神经保护药物应用到CVD临床治疗将为时不远。

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