中药指纹图谱研究与应用进展Δ

刘文，蒋世云

（广西工学院生物与化学工程系，柳州市 545006）

中药指纹图谱研究与应用进展Δ

刘文＊，蒋世云#

（广西工学院生物与化学工程系，柳州市 545006）

目的：全面系统地阐述中药指纹图谱的研究应用发展状况。方法：查阅国内外文献资料，对各种方法进行分析、归纳和总结。结果：中药指纹图谱分为中药化学指纹图谱和中药生物指纹图谱。中药化学指纹图谱中以色谱法最为常用，尤其是高效液相色谱法；生物指纹技术对药材种类的鉴别具有高通量、大规模、准确性高等优势，但不能鉴别药材的道地性。技术联用以获得多维信息也是目前的主流。结论：建立中药指纹图谱质量控制体系，尤其是构建相关生物活性成分多维的指纹图谱，是中药材、半成品和成品质量控制标准的发展方向，将生物指纹技术配合主要药效成分的测定用于中药质量的控制是目前较为合理的方法。

中药；质量控制；指纹图谱；现代生物技术

中药是我国一大国宝。现代科学研究表明，中药的疗效与其活性成分的种类、含量等有关，因此要实现中药现代化，对中药材、半成品和成品的质量控制标准必须以其有效成分的种类、含量等作为指标，才能保证中药的“安全、有效、稳定、可靠”[1]。

中药指纹图谱是运用现代分析技术对中药化学信息以图形的方式进行表征并加以描述[1]，是一种综合分析多种成分的有效手段。其具有系统性、特征性和重复性，显示中药质量控制标准的整体性与模糊性[1]，更具有科学性，因而受到国际上的认可。从中药材到中成药的生产过程中，每一步都有明确的控制指标，而指纹图谱就是将这些指标图形化、信息化，为生产者提供一双明亮的“眼睛”，保证中药生产各环节的质量，为中药现代化保驾护航。

1 中药指纹图谱的研究与应用

中药成分的复杂性决定其质量控制指标为非单一成分。为了获得其有效的化学信息，中药指纹图谱应运而生。它是这些信息的综合结果，能够成为中药自身的“化学条形码”[1]。随着边缘学科新技术的不断发现，出现了许多具有说服力的控制方法。为了获得中药全面的信息，可以采用多项仪器联用。而且，随着生物技术的发展，生物芯片以其高通量、大规模等特点在中药质量控制中的应用也越来越广泛。根据测定手段获得的指纹图谱可分为：中药化学指纹图谱和中药生物指纹图谱。

1.1 中药化学指纹图谱

1.1.1 光谱法 利用被测物质对光的吸收而被用于有机化合物分子的结构鉴定和对中药有效成分的定性、定量分析。光谱法是近几十年发展起来的科学技术，已成为中药材真伪鉴别及质量控制的重要参考手段。以紫外光谱（UV）法、红外光谱（IR）法和近红外光谱（NIR）法最为常用。

UV法：用于化合物结构的鉴别和含量的测定。其光谱是电子光谱，形状变化不大，不具备指纹特征，但可依据吸收峰的数目及峰的相对位置来鉴别中药。邢旺兴等[2]测定7种红曲药材甲醇提取液的UV光谱，并结合一阶导数光谱，根据峰位置差异能够鉴别不同品种的红曲。

IR法：是鉴别化合物和确定物质分子结构的常用手段。其以宏观的、非线性的分析理念和质量控制模式评价中药的真伪优劣，具有无损鉴别、仪器通用等优点。成则丰等[3]测定不同产地野生、种植天麻与伪品芭蕉芋、芋及马铃薯的水平衰减全反射-傅里叶变换红外光谱，并转化为傅里叶自解卷积光谱，在4000～650cm-1内能简便、准确地识别天麻及其伪品。而Fourier转换红外光谱法联合二次衍射光谱及二维红外光谱鉴定药材，具有快速、易操作与很好的重现性[4]。

NIR法：由于试样选择性吸收不同频率的近红外光，导致透射的近红外光线就携带组分结构的信息。NIR法具有快捷、不破坏样品等优点，但必须采用一定的数据处理才能克服谱图重叠多的缺点。赵龙莲等[5]采集95个大黄样品的近红外漫反射光谱，用小波包熵进行特征提取和Fisher分类器相结合，其建模集与预测集的误判率均低于采用主成分分析的结果，为其快速真伪鉴别提供了参考。

1.1.2 色谱法 是分离纯化和定性、定量鉴别中药成分的重要方法。利用样品中各组分在互不相溶的两相之间的作用力不同，使各组分达到分离。以高效液相色谱（HPLC）法、薄层色谱（TLC）法、气相色谱（GC）法、超临界流体色谱（SFC）法和高速逆流色谱（HSCCC）法最为常用。

HPLC法：是近几十年发展起来的已成为中药质量控制主要手段的一种分析方法，具有分离速度快、分离效率高、检测灵敏度高等优点。周婧等[6]用HPLC法分析9个不同产地的西洋参得出图谱中含有18个共有峰，并且与以6种人参皂苷为对照品的图谱作相似度计算，结果均＞0.85，建立的指纹图谱可作为该药材评价、制定质量标准的参考。

TLC法：是一种经典的平面色谱方法。由于它的多路柱效应、样品的静态检测、灵活的色谱后衍生化等特点，已成为中药成分分析的一个首选方法。黎俊华等[7]用TLC法完善了溶栓丸的质量控制标准。而微乳色谱法鉴定药材活性成分具有更高的灵敏度和更好的分离效果，且Rf值高的成分无扩散现象[8]。

GC法：是一种以气体为流动相的分离技术，适用于挥发性成分或衍生化后挥发性成分的检测，但只能分析低沸点物质。其具有简单易行、可比性强等优点。郑宵蓓等[9]测试分析18种半夏，以5种甾醇类成分为特征峰的指纹图谱可作为其质量控制的方法。而仪器的联用分析多种化合物具有一定的优越性。Qiu YQ等[10]用GC×GC-TOFMS和GC×GC-FID分析羌活中的化合物，结果表明四川的羌活成分明显不同于其他地区。Adahchour M等[11]总结了2004－2006年GC-GC联用的发展及应用。

SFC法：是20世纪80年代兴起的以SFC为流动相的一种分离方法，适合不稳定的挥发性成分和脂溶性物质的提取分离。其具有提取率高、产品纯度好、不破坏天然产物的活性及结构等优点。李云华等[12]用SFC获得三七、田七花等的指效图谱可作为其鉴别依据。

HSCCC法：是一种液-液分配色谱方法，因无不可逆吸附、两相充分接触而能获得更好的分离效果。其具有操作条件温和、分离效果好等优点。OuYang XK等[13]用HSCCC预分离雷公藤中4种主要的生物碱，以石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水溶剂系统中的有机相作为固定相，水相作为流动相，一步分离就能达到很高的分离纯度。由于HSCCC指纹图谱包含更多的化学成分信息，研究证明其在中药质量控制中具有可行性和低耗费[14]。

1.1.3 质谱（MS）法 中药各成分分子在MS仪中被裂解为不同的碎片，成分不同则其图谱显示的碎片峰也不相同。但MS一般与色谱联用以获得多维信息特征谱。Lu HM等[15]用GC-MS分析34家制药厂的340批鱼腥草注射剂，以15种主要的共有成分作为特征峰所建立的指纹图谱结合目前的质量保证标准，被建议作为其质量控制的依据。Ren MT等[16]用HPLC-ESI/TOF-MS同时检测8种药用金银花中32种活性成分，并且检测出6种未知活性成分，具有很高的选择性和准确性。而数字图像识别技术的使用为多维指纹图谱的分析提供了一种新的途径[17]。

1.1.4 核磁共振（NMR）法 是可以同时获得化合物的多个结构信息、鉴别化合物结构的主要手段。其提取分离特征性化学成分总提取物，纯化得到单体，使用结构鉴定与NMR研究，对指纹图谱中的各特征谱线进行归属，实现对中药质量的控制。具有较高的稳定性和重复性。核磁共振氢谱（1H-NMR）因其较高的灵敏度而被广泛采用。时新刚等[18]研究北沙参的1H-NMR，根据有效成分特征共振峰来鉴别其真伪。

1.1.5 X射线衍射法 物质的组成、分子的构型等决定该物质产生特有的衍射图谱，是各组分衍射效应的叠加，具有指纹性强、结果稳定可靠等优点。刘小平等[19]用此法获得的指纹图谱能快速鉴定六味地黄丸。X射线衍射二阶导数指纹图谱的出现克服了传统衍射指纹图谱峰重叠、峰形不明显等缺点[20]。而X射线指纹图谱专家系统网格的构建能提高中药分析鉴定的效率[21]。

1.1.6 免疫测定法 具有简单、快速、特异性高和可靠等优点。Morinaga O等[22]在聚醚砜（PES）膜上分离柴胡提取物中的柴胡皂苷并用抗SSA的单克隆抗体进行免疫染色，用美国国立卫生研究院（NIH）图像分析软件分析SSA及总柴胡皂苷含量，得到的结果与酶联免疫吸附测定法相符。

1.2 中药生物指纹图谱

现代生物技术产生于20世纪50年代，已广泛用于中药质量控制。近年来许多新学科、新理论和新试验技术不断渗透到中药鉴定领域，弥补了中药鉴定和质量控制的一些不足，也展示了生物技术在该方面的重要性。

1.2.1 电泳技术 带电样品在惰性介质中于电场的作用下使组分分离成狭窄的区带，用相应的方法记录其区带区谱或计算其含量。以蛋白质电泳、同工酶电泳和毛细管电泳较为常用。

蛋白质电泳：具有耗费低、重现性好等优点。可其图谱主要靠肉眼比较，影响了结果的准确性。李桂兰[23]电泳苦杏仁及混伪品的可溶性蛋白质，根据特征性谱带的差异可鉴别该药材的真伪。

同工酶电泳：为生物组织提取液电泳，酶活性染色后，可以看到酶谱带。酶谱带特征具有种特异性、发育阶段特异性和组织特异性，具有简洁、清晰等优点，但必须取新陈代谢活跃的部分，因此限制了其在干燥药材鉴别上的应用。李桂兰[24]用电泳鉴别菘蓝过氧化物酶（POD）同工酶，其酶谱带为其生长发育的调控研究和开发利用提供了参考依据。

毛细管电泳法：具有分离效率高、快速、无环境污染等优点。王磊磊等[25]用此法分析8种白芍样品和7种赤芍样品得出的指纹图谱中白芍、赤芍共有峰的个数为15和10，可用于该药材的质量控制。在毛细管区带电泳、胶束电泳色谱法、非水相毛细管电泳、微胶乳电泳色谱法中，非水相毛细管电泳克服了水相中溶解度低的不足，并具有良好的选择性，因而被认为是最好的技术[26]。

1.2.2 分子生物技术 应用广泛的是DNA分子标记法。在DNA上检测生物间的差异具有重复性好、灵敏度高等优点，可成为中药品种鉴别可靠的依据和手段。主要有聚合酶链式反应（PCR）和随机扩增多态DNA（RAPD）法等。曹晖等[27]用分子生物技术扩增蒲公英及混淆品的基因组DNA，根据DNA带型差异可鉴别该药材。中药植物的rDNA序列如ITS1、ITS2、5.8S全长序列及18S、26S部分序列作为有效分子标记，电泳后获得的特征图谱可用来鉴别[28]。

1.2.3 生物芯片技术 将生命科学研究中所涉及的不连续分析过程，利用微电子、微机械、化学、物理、计算机技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，使之连续化、集成化、微型化。主要有基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室。

基因芯片：将许多特定的碱基片段固定于载体上，标记待测核酸，杂交后检测杂交信号强度，计算机软件综合分析即可获得样品中大量基因序列特征。其前提是获取不同中药基因分型。蔡佩欣等[29]开发的DNA芯片为贝母种属的验证与质量控制提供了一种快速的检测方法。随着研究的深入，人们开始把目光投向于中药活性成分的作用机制。谢守霞等[30]用基因芯片分析银杏叶提取物对小鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用机制。结果显示，皮层内多种与脑功能相关的基因表达上调。该研究从基因水平提示其可能的作用机制，使得人们在基因水平上了解中药的作用机制，给人们使用中药安下一颗“定心丸”；也为中药质量控制指标的确定提供了科学依据。

蛋白质芯片：将各种蛋白质固定于滴定板等载体上成为检测用的芯片，用标记的成分与芯片作用，漂洗后采集各反应点的荧光强弱和荧光位置，经软件分析图像即可获得有关的生物信息。王若光等[31]采用蛋白质芯片技术分析地龙生干品和炮制品，获得蛋白质/肽成分的质量指纹图谱分别含17和12个意义峰，可作为其数字化质控标准，并为进一步分离、纯化及验证地龙功能相关活性成分打下基础。

芯片实验室：不仅可以将同一个实验的多个步骤集成到一步完成，还能将多种实验集成到一张小小的芯片上。是将样品制备、生化反应及检测等过程集约化形成的微型分析系统。但由于技术上的难题，其应用还存在相当大的困难，因而目前关于用芯片实验室鉴定中药材的报道很少。但可以认为芯片实验室是生物芯片发展的趋势。

2 展望

随着人类对中药需求量的扩大，以及人类用药安全意识的加强，中药质量控制已显得格外重要。中药指纹图谱作为一种有效的质量控制模式，以其科学的理论依据获得国际上的一致认可。HPLC法是目前中药质量控制的主要手段。多种仪器联用以获得多维信息也是目前的主流。然而，其控制的指标还处于发展完善中，还有待对各类中药的药理、药效、药动及生物等效性的相关性的深入研究。值得注意的是，通过从受体角度和中药生物效应入手，建立中药生物效应鉴定法来实现对中药质量的控制，也是目前研究的热点和有望成为中药质量标准化控制的重要途径。

而用生物指纹技术如rDNA特征序列标记法、生物芯片等获得的生物指纹图谱，对药材种类的鉴别具有高通量、大规模等特有的优势，但若仅仅是关于中药的生物性，虽说有上述优点，但其不足之处就是未能鉴别中药材的“道地”性，因为道地药材质量高、药效好的根本原因是其生物性与环境因子综合作用的结果。因此，将生物指纹技术配合主要药效成分的测定用于中药质量的控制是目前较为合理的方法。另一方面，生物芯片技术能够从基因水平上解释中药的作用机制，即用基因芯片分析中药对基因的作用，用蛋白质芯片分析药物对基因的表达情况，因此生物芯片技术对中药药效成分的确定及作用机制的研究具有重要的意义，也将促进中药质量控制指标的发展和完善。

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R282.5；R931.5

A

1001-0408（2011）19-1819-04

Δ国土资源部广西壮族自治区岩溶动力学重点实验室开放课题（kdl2008-14）

＊硕士研究生。研究方向：生物制药。E-mail：l.w2009@163.com

#通讯作者：教授，硕士研究生导师，博士。研究方向：生物制药工程。E-mail：jiangshiyun@126.com

2010-06-03

2011-03-12）

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