抗菌肽酵母表达系统的研究进展

东北农业大学动物科技学院 李 静 冯兴军＊ 宋雪莹

抗菌肽是生物体内经诱导产生的一类具有生物学活性的小分子多肽，存在于多种生物体中，是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分（Brogden和 Kim，2005），广泛分布于细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物以及人类体内（Robert，2001）。抗菌肽具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等作用（Jin 等，2006；Li等，2005）。 和抗生素相比，抗菌肽具有分子质量小、水溶性好、耐热性强、无免疫原性、抗菌谱广、无耐药性和作用机制独特等特点，因此被认为是能够成为替代抗生素的首选药物。近几年来，有关抗菌肽及其应用逐渐成为药理学、免疫学、分子生物学等领域研究的热点，抗菌肽在医药卫生、农业生产以及食品工业等领域都具有广泛的应用前景。但其来源和制备是限制抗菌肽应用的主要瓶颈。目前通过基因工程方法制备抗菌肽为其提供了手段，酵母表达系统在表达抗菌肽方面具有多方面优势，本文综述了酵母表达系统重组表达抗菌肽的最新研究进展。

1 抗菌肽概述

依据其来源，可将抗菌肽分为微生物抗菌肽、植物抗菌肽和动物抗菌肽。根据氨基酸形成和结构特征，可将抗菌肽分为4类：天蚕素类、防御素、蛙皮素、蜂毒素（Brahmacharym等，2004）。对于抗菌肽的作用机理，不同学者有不同的看法，目前研究的最为清楚的是膜渗透机理，认为大多数抗菌肽的作用机理是抗菌肽利用自身结构特点，在细菌细胞膜上形成电势依赖性通道，改变细胞膜的通透性，造成细胞内容物外泄而死亡。具体过程是抗菌肽分子通过其两亲性α-螺旋上的正电荷与细菌细胞质膜磷脂分子上的负电荷之间的静电吸引而结合在质膜上，紧接着抗菌肽分子中的疏水端插入到质膜中，之后α-螺旋也插入到质膜中，这样就打乱了质膜上蛋白质和脂质原有的排列秩序，使细菌失去了膜势，不能保持正常的渗透压而死亡（Lehrer等，1989）。

2 毕赤酵母表达系统表达抗菌肽的优势

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种甲基营养型酵母，在缺乏抑制性碳源（如葡萄糖、甘油）时，能利用甲醇作为唯一碳源。巴斯德毕赤酵母表达系统经长期发展，已基本成为可以生产多种融合蛋白的高效表达系统。它不仅可以克服大肠杆菌表达系统缺乏转录后加工修饰的缺陷，生产可溶的、具有正确折叠的重组蛋白，而且可以对蛋白进行转录后加工（Daly 和 Hearn，2005）。

由于从天然资源中提取抗菌肽成本高、得率低、工序繁琐，化学合成则价格相当昂贵，难以应用生产，因此，利用基因工程技术生产抗菌肽具有重要意义。抗菌肽本身对原核宿主菌的杀伤作用，不适合在原核系统中直接表达，一般选用真核表达。由于毕赤酵母表达系统不仅具有原核表达系统繁殖迅速、费用低廉及操作方便的特点，还具有真核表达系统能对表达的蛋白进行正确加工、折叠及适度糖基化的优点，因此已越来越广泛地用于蛋白质的表达，目前为止已有许多蛋白质都利用巴斯德毕赤酵母表达系统进行了成功重组表达（Macauley-Patrick等，2005）。利用酵母表达系统表达抗菌肽，具有以下优点：（1）酵母自身分泌到培养基中的蛋白质较少，简化了后期蛋白质的分离与纯化，且高分泌的外源蛋白可从无蛋白质的培养基中分离出来。（2）酵母中存在酵母醇氧化酶AOX1，特别适用于外源蛋白质的调控表达。（3）和大肠杆菌表达系统相比，毕赤酵母表达产物的累积不会对自身产生毒害作用，由于毕赤酵母存在过氧化物酶体，表达的蛋白质贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。HD5α（人源α防御素5）对原核表达宿主有毒害作用，而选择毕赤酵母表达系统，使HD5α获得成功表达（Wang等，2009）。 （4）毕赤酵母表达菌株很容易从摇瓶培养扩大到大批量高密度发酵，且不影响外源基因的表达水平，为抗菌肽的大规模生产奠定基础。申艳敏等（2008）选择毕赤酵母偏好密码子，高效表达人源抗菌肽LL-37基因。Kim等（2009）将人源抗菌肽 pPICZaA：：hCAP18/LL37 质粒整合到毕赤酵母（X33）的5’-AOX1部位，成功表达了LL37。

3 毕赤酵母表达抗菌肽的策略

为了提高抗菌肽的表达量，消除溶血性，增强抗菌活性，采用了各种不同的表达策略利用毕赤酵母表达系统进行表达，包括直接表达、融合表达、改造后表达、串联表达等，均得到较为理想的结果。

3.1 抗菌肽的改造后表达 有些抗菌肽有溶血作用，且抗菌活性相对较弱，但经人为改造后会明显增强其抗菌活性，溶血毒性降低或消失。Cao等（2010）根据天蚕素和蜂毒素的氨基酸序列重新设计改造后获得两种新型抗菌肽CA （1-7）-M （4-11） （CAM） 和 CB（1-7）-M（4-11） （CBM），并分别在毕赤酵母中成功表达和纯化后，经活性测定后发现两种抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎杆菌、芽孢杆菌、苏芸金杆菌和沙门氏菌均有较强的抗菌活性。CAM和CBM的MIC 值分别为 100 μg/mL 和 125 μg/mL， 其相对效价分别为0.862和0.849。经溶血活性测定，显示CAM和CBM在体内和体外均没有溶血性，具有良好的应用前景。姜新等（2007）参照毕赤巴斯德酵母的偏好密码子，改造克隆杂合抗菌肽CAM和CBM基因，将改造后的基因克隆到pPICZα-A载体中，构建分泌型表达载体pPICZα-A-CAM和pPICZα-A-CBM，在甲醇的诱导下进行表达，结果表明，杂合抗菌肽获得表达，两种表达产物具有明显的抗菌活性。张建峰等（2008）参照Tossietal的分析方法，在天然哺乳动物cathelictidin家族抗菌肽序列比较和两亲性分析的基础上，提取出两亲α-螺旋抗菌肽模式肽PGYa，然后根据其氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，设计合成了新型抗菌肽模式肽PGYa基因，利用毕赤酵母表达系统成功分泌表达了这种分子质量约为2.8 kDa的PGYa。经测定，PGYa对革兰氏阴性的 Escherichia coli DH5α有一定的抑杀作用。Jin等（2006）等首次在酵母表达系统中表达分子质量小于3.0 kDa的外源杂合抗菌肽CA-MA（天蚕素A（1–8）–马盖宁 2（1–12）），并获得较强抗菌活性。

3.2 抗菌肽的串联表达 Niu等（2008）为了获得高活性的抗菌肽，将4种抗菌肽的基因序列串联起来，在每种抗菌肽N基端加上生产Kex2酶切位点，然后将编码4种抗菌肽的基因连接与pPICZαA的α-分泌信号肽后端，构建表达载体，转化毕赤酵母，经甲醇诱导表达后，串联的4种抗菌肽成功获得表达，且大部分以单体存在，经测定重组表达的抗菌肽具有热和酸稳定性，且对多种革兰氏阴性和阳性菌有较高的抗菌活性。王秀青等（2007）通过重叠区扩增基因拼接法（SOE）合成抗菌肽天蚕素B基因，并在其N端引入Kex2酶切位点。亚克隆天蚕素B并将3个亚克隆串联在一起，每个单体前都加上Kex2酶切位点，将天蚕素B以及串联体连接与表达载体pPICZαA，用SacⅠ酶切使之线性化，电击法转化毕赤酵母SMD1168，成功获得表达，经检测，表达产物具有明显抑菌活性。

3.3 抗菌肽的融合表达 乔红伟等（2008）将中国林蛙皮肤抗菌肽基因（RC）克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上，使之准确融合于α-分泌信号肽后端，构建pPIC9K/RC，然后通过电击转化毕赤酵母宿主菌GS115/His-。将筛选出的高效表达的重组转化子用甲醇作诱导剂进行小瓶发酵，28～30℃诱导后，表达产物在α信号因子引导下分泌到培养基中，分泌到培养基中的表达产物能够抑杀细菌和抑制肿瘤细胞生长。

3.4 抗菌肽的直接表达 很多抗菌肽由于其自身的结构特点无需改造加工，可直接在酵母中进行表达，且能获得高效表达。蔡晶等（2009）将黑鲷抗菌肽hepcidin前体肽和成熟肽Pro-AS-hepc2基因与酵母表达载体连接，构建的表达载体，利用α-分泌信号肽进行分泌表达，转化毕赤酵母菌株GS115，在甲醇诱导下成功表达了黑鲷Pro-AS-hepc2，至120 h表达量最高，表达产物有显著的抑菌活性，对革兰氏阳性细菌、阴性细菌都有作用，证明获得了有抗菌活性的重组Pro-AS-hepc2表达产物。

4 展望

由于抗菌肽无残留、无毒害且具有良好的广谱抗菌性能，正受到越来越多的关注。随着对抗菌肽的性质和特征进一步研究，发现用不同表达体系表达效果不同。近年来利用毕赤酵母表达系统已经成功表达了多种抗菌肽，但仍需探索提高抗菌肽表达量、增强抗菌活性的方法。

[1]蔡晶，杨明，蔡灵，等.黑鲷抗菌肽hepcidin在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性[J].厦门大学学报，2009，48（5）：738 ～ 743.

[2]姜新，马根，许正超，等.两种杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及活性测定[J].四川大学学报，2007，44（3）：673 ～ 678.

[3]乔红伟，韩俊友，赵瑞利，等.中国林蛙抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达及其活性检测[J].中国兽医学报，2008，28（6）：663 ～ 671.

[4]申艳敏，魏建超，尚书文，等.人源抗菌肽LL-37在毕赤酵母中的高效表达及其活性检测[J].微生物学通报，2008，35（4）：539 ～ 544.

[5]王秀青，张素芳，曹瑞兵，等.抗菌肽天蚕素B基因及其串联体在毕赤酵母中的表达[J].南京农业大学学报，2007，30（3）：120 ～ 123.

[6]张建峰，蒋宗勇，唐兆新，等.抗菌肽模式肽PGYa的分子设计、克隆及在毕赤酵母中的分泌表达[J].农业生物技术学报，2008，16（1）：154 ～ 157.

[7]Brahmacharym，Krishan S P，Koh J L，et al.A database of antimicrobial sequences[J].Nucleic Acids Res，2004，32（1）：586 ～ 589.

[8]Brogden，Kim A.Antimicrobialpeptides：pore formersormetabolic inhibitors in bacteria[J].Nature Reviews Microbiology，2005，3：238 ～ 250.

[9]Cao Yu，Yu Rong-qing，Liu Yi，et al.Design，recombinant expression，and antibacterial activity of the Cecropins-Melittin hybrid antimicrobial peptides[J].Current Microbiology，2010，61（3）：169 ～ 175.

[10]Daly Rachel，Hearn M T W.Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris：a useful experimental tool in protein engineering and production[J].Journal of Molecular Recognition，2005，18：119 ～ 138.

[11]Jin F l，Xu X X，Wang L X，et al.Expression of recombinant hybrid peptide cecropinA （1 ～ 8）-magainin2 （1 ～ 12）in Pichia pastoris：Purification and characterizaion[J].Protin Expression and Purification，2006，50：147 ～ 156.

[12]Jin F L，Xu X X，Zhang W Q，et al.Expression and characterization of a housefly cecropin gene in the methylotrophic yeast，Pichia pastoris[J].Protein Expression and Purification，2006，49：39 ～ 46.

[13]Lehrer R J，Barton A，Daher K A，et al.Interaction of human defensins with Escherichia coli：mechanism of bactericidal activity[J].Journal of Clinical Investigation，1989，84：553.

[14]Li L，Wang J X，Zhao X F，et al.High level expression，purification，and characterization of the shrimp antimicrobial peptide，Ch-penaeidin，in Pichia pastoris[J].Protein Expression and Purification，2005，39：144 ～ 151.

[15]Macauley-Patrick S，Fazenda M L，McNeil B，et al.Heterologous protein production using thePichia pastorisexpression system[J].Yeast，2005，22：249 ～270.

[16]Niu M F，Li X，Wei J C，et al.The molecular design of a recombinant antimicrobial peptide CP and its in vitro activity[J].Protein Expression and Purification 2008，57：95 ～ 100.

[17]Robert E W H.Cationic peptides：effectors in innate immunity and novel antimicrobials[J].The lancet Infectious Diseases，2001，1：156 ～ 164.

[18]Wang A P，Wang S，Shen M Q，et al.High level expression and purification of bioactive human α-defensin 5 mature peptide in Pichia pastoris[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2009，84：877 ～ 884.