基因芯片技术在中药肿瘤药理研究中的应用

王珊珊，廖清船，许静，徐康康（南京医科大学附属南京儿童医院，南京市210008）

人体是一个复杂的网络系统，疾病的发生和发展必然牵涉到网络中的诸多环节。基因芯片技术的出现使综合、系统分析某些生命现象成为可能。它可以同时进行许多基因的检测，彻底改变了传统的分子生物学方法只能对某一个或某几个基因进行研究的局限。而基因芯片可以从疾病和药物两个角度对生物体的多个参量同时进行研究，以发掘药物靶点并同时获取大量其他相关信息。因此在这种情况下，任何一元化或相对一元化的分析方法均不及基因芯片的分析手段更具有优势[1，2]。

采用基因芯片对基因表达进行分析，可随时获取肿瘤细胞生长各期与肿瘤生长相关基因的表达模式，以对肿瘤的发生、发展有一个系统、深入的阐析[3]。现代药理学分子水平的研究已明确药物作用都有其“靶基因”，基因芯片技术的出现为我们提供了一个从基因层次全面探讨中药肿瘤药理的契机[4]。基因芯片以高通量、多因素、微型化和快速灵敏的特点而见长，能够针对中药的多成分、多途径、多系统、多靶点的作用特点进行系统深入的研究，为探索中药抗肿瘤的作用机制、毒副作用、作用新靶点及药物筛选等现代中药研究开辟了崭新的领域。

1 基因芯片技术概述

基因芯片是融微电子学、生物学、物理学、化学及计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值和明显的产业化前景，是目前生物技术的热点和前沿。基因芯片是将许多特定的DNA寡聚核苷酸或DNA片段（称为探针）固定在芯片的每个预先设置的区域内，通过碱基互补配对原则进行杂交，检测对应片段是否存在及其存在量。该技术可用于基因的功能研究和基因组研究、疾病的临床诊断和检测等方面[5]。在中药肿瘤药理研究中，可用基因芯片寻找药效相关基因，该芯片既可用于药效物质的检测和遗传多态性的检测，又可用于受检药效物质作用机制的研究，同时还可用于药效相关基因的功能研究。

2 基因芯片技术在中药肿瘤药理研究中的应用

肿瘤是一种涉及多个阶段、多条通路、多个基因的病变，基因芯片的发明和应用，为研究肿瘤细胞或组织中基因表达的差异及基因表达差异谱的建立，提供了一种非常快捷、方便、准确的方法。中药抗肿瘤的药理作用还具有多组分、多途径、多靶点的特点，采用“利用基因芯片建立基因表达差异谱”技术，可以全面研究中药对基因表达水平的影响，从而为揭开中药作用的“黑匣子”提供有效的依据。

2.1 在中药抗肿瘤作用机制研究中的应用

药物发挥功效主要通过不同的作用靶点作用于组织细胞，直接或间接地影响细胞内基因的表达。鉴于中药抗肿瘤作用机制的复杂性，利用高密度的基因芯片检测给药前后基因表达谱的差异是研究者开展中药肿瘤药理研究的共同途径。

2.1.1 在抗肿瘤单体化合物作用机制研究中的应用 陈明伟等[6]采用基因芯片技术检测人参皂苷Rg3对人肺腺癌细胞株A549细胞基因差异表达的影响，从基因水平进一步探讨其作用的靶点。结果显示，10-6mol·L-1浓度Rg3对A549细胞基因表达有显著影响，其中表达下调的基因有14个，分别是原癌基因和抑癌基因TNFAIP3、SAFB和MN1，蛋白翻译合成基因STIP1和EEF2，既有DNA合成修复和重组蛋白作用，又有代谢功能的基因POLG、免疫相关基因CD1及其他功能基因7个。表达上调的基因有10个，它们是蛋白翻译合成基因NCOA2、代谢相关基因POLR3K、细胞信号和传递蛋白VRK1和KIAA0164、细胞骨架和运动基因KIAA0133、HSPG和其他功能基因4个。可见，Rg3可同时作用于A549细胞多个靶点。黄益玲等[7]通过基因表达谱分析首次提出天花粉蛋白诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的作用机制，发现与细胞凋亡密切相关的NOP56、TN-FSF10、CASP9、DFFB等62条基因表达上调，与细胞黏附及细胞间相互作用相关的COL9A3、MGST3、LGALS3BP等16条基因表达下调。这些研究从基因芯片表达的角度探索中药的分子层面作用机制，为进一步阐明复方和复杂网络奠定了基础。

2.1.2 在抗肿瘤单味中药作用机制研究中的应用 王怀宇等[8]应用包含1 003条人类基因的cDNA表达谱芯片检测雄黄作用于急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4前后基因表达的变化。NB4细胞在雄黄作用12 h后，共有9条基因上调，37条基因下调，其中2条参与蛋白酶体降解途径的基因显著上调，多条与细胞信号传导、RNA加工及蛋白质合成相关的基因下调。提示PSMC2、PSMD1及ITGB1基因表达的改变可能与NB4细胞的分化和凋亡有密切关系。

Iizuka N等[9]对黄连水提物及单体成分小檗碱的作用进行了对比研究，结果发现药材的水提液要比纯单体成分在杀伤肿瘤细胞方面更有效，并且借助含有11 000个基因的单核苷酸序列分析癌细胞系给药前后基因表达谱的差异，阐明两者的分子机制有不同之处。其中，癌细胞中的RECQL基因（可通过修复癌细胞DNA而引起多药耐药性）表达水平的增高与耐受小檗碱呈正相关，但对黄连水提液则无此效应；另外拓朴异构酶Ⅱα（TOP2A）的mRNA水平也与耐受小檗碱呈正相关，对黄连水提液也无此效应。原因可能是药材的提取液中含有多种小檗碱的衍生物，它们对癌细胞的拓朴异构酶Ⅱ和拓朴异构酶Ⅰ都能起作用，因此从更深层次上解释了黄连水提液抗癌细胞效果强于小檗碱单体的药理机制。

2.1.3 在抗肿瘤中药复方作用机制研究中的应用 基因芯片可以将中药复方多组分、多靶点、多途径的作用特点与基因表达联系起来，比较各自不同的表达差异谱，根据不同配伍组方对应基因靶点的相互作用，分析各组成复方单药之间的密切关系，阐明药物作用的物质基础及内在的配伍规律。赵爱光等[10]通过cDNA微阵列的方法，初步研究健脾类中药胃肠安复方在体内对人胃癌SGC-7901细胞基因表达谱的影响。对照组与胃肠安复方组间共有45个2倍以上差异显著的表达信号，分别为24个上调基因和21个下调基因，进行初步分类后发现胃肠安复方组对SGC-7901细胞基因表达的影响可能涉及癌基因、细胞分裂相关基因、分化/发育相关基因、调亡基因、细胞受体、信号转导、免疫相关、代谢相关及其他基因等10类。沈晔华等[11]研究了中药清胰消积方对裸鼠体内人胰腺癌SW1990细胞移植瘤的抑瘤作用，并利用基因表达谱芯片探索其作用机制，发现调节癌基因及其相关的信号传导、改变肿瘤细胞蛋白合成等可能是其作用机制。中药复方成分复杂，采用传统的研究方法，或从影响细胞增殖、或从影响凋亡、或从免疫调节等单个环节进行研究，工作缺乏系统性，也无法探求其主要的作用环节和靶点或对其多重作用之间有无内在的联系作出令人较为信服的解释。cDNA微阵列的出现，使探讨中药复方对肿瘤细胞在基因表达水平的主要作用环节和靶点成为可能。

2.2 在抗肿瘤中药毒副作用研究中的应用

某些具有抗肿瘤药理效应的中药，也可能同时干扰正常细胞组织代谢的其他环节而导致毒副作用，某些抗肿瘤中药中的毒性成分又是有效成分。因此，了解其剂量与毒副作用之间的关系非常重要。观察药物处理后细胞、组织和器官基因表达的差异，可以对药物的毒性程度及代谢特点有初步的了解。将可能受中药毒性影响的基因，包括凋亡、细胞周期调控、药物转化和代谢、DNA复制及修复、热休克、氧化应激反应等相关的基因，制备成基因芯片，从动物或暴露于药物的培养组织中提取的相匹配遗传物质与芯片上的探针结合，根据检测到的信息分析药物中的有毒成分，从而采取防护措施，控制剂量范围，寻找拮抗药物等，以避免毒副作用的发生[12]。

2.3 在发现中药抗肿瘤新靶点中的应用

在药物开发过程中发现和选择合适的药物靶点是药物开发的第一步，也是药物筛选和药物定向合成的关键因素之一。药物靶点发现与药物作用机制研究是生物芯片技术在药物研发中应用最为广泛的一个领域。例如，鬼臼亚乙苷是p53活化拓扑异构酶Ⅱ的抑制剂，在临床上作为一种抗肿瘤药物。Wang Y等[13]经用鬼臼亚乙苷作用人成骨肉瘤细胞系U2-OS后，根据不同的时间间隔分别提取细胞mRNA，用寡核苷酸芯片测定6 591条mRNA表达的变化，发现62条mRNA表达有变化。通过选取其中12条基因作进一步研究，发现有2条是已知的p53调控基因（WAF1/p21和PCNA），有2条是新的p53靶基因，其余的与p53无关。在实验基础上，他们提出了介导鬼臼亚乙苷诱导细胞凋亡的信号传导途径，这使我们又多获得一种抗肿瘤药物的靶点。

2.4 在中药抗肿瘤新药筛选中的应用

用基因芯片大规模平行分析基因表达的情况，从而进行新药的研究和开发可以节省大量的动物实验，甚至临床试验，还可进一步分析药物对靶细胞及非靶细胞的毒性作用，确定药物临床应用的可行性及最佳的用药剂量，从而为新药的开发提供一种高速度、高灵敏度的安全指标，降低用药风险，抗肿瘤中草药的筛选与开发是研究的热点领域[14]。

2.4.1 中药抗肿瘤新药筛选研究近况 建立肿瘤疾病的基因芯片，并以此检测药物作用后基因的表达差异，从而对单味药的各种化学成分或不同的复方进行筛选和分析，找出确定的有效成分或合适的组方供进一步进行新药研究。Hara A等[15]利用寡核苷酸芯片分析抗肿瘤草药黄连根及其8个组成分子的12 600个基因，经过生物信息学处理，最终确定黄连素是黄连抗增殖的效应部位，并佐证了DNA芯片用于单味中药的效应部位分析。

托娅等[16]利用基因芯片技术，以人胃癌BGC823细胞和血管内皮细胞（EC）对中药提取物T3进行筛选。发现T3对2种细胞系的基因表达谱均有明显影响，其抗肿瘤的机制是多途径、多方面的，可能通过阻断介导的细胞信号转导通路引起一系列级链反应，最终使肿瘤细胞发生凋亡，并且对抑制肿瘤细胞的侵袭和转移有一定的作用。利用高密度芯片技术可以从中药中寻找新的有效成分，是目前一大趋势。

2.4.2 中药抗肿瘤新药筛选研究思路及方法 肿瘤的发生除肿瘤细胞自身存在众多的基因表达外，它更是一个全身性疾病的局部反应，是机体作为一个生物系统的整体平衡失调的结果。将肿瘤作为全身性病变进行药物筛选，应用基因芯片技术研究中药在肿瘤发生不同阶段中的相关靶组织的基因变化，从研究其能提高哪些基因的表达，抑制哪些基因的表达着手，了解与中药能起反应的基因。用基因表达差异谱筛选中药抗肿瘤药物，为中药现代化研究提供了一个全新的思路和方向[17]。其方法为：（1）建立肿瘤的动物模型，寻找肿瘤相关靶组织：建立肿瘤的动物模型，设立相同数量的模型组和对照组。根据中医整体观的思想，选取动物机体主要组织，利用基因芯片，通过组织中总RNA的提取、标记探针的制备、与芯片的杂交、芯片扫描、计算机图像数据处理后，即可建立各组织的肿瘤-正常基因表达谱。排除基因表达无差异的组织，有差异组织即为肿瘤的相关靶组织。（2）建立肿瘤发生不同阶段的相关靶组织的疾病-正常基因表达差异谱：根据肿瘤发生的不同阶段，用基因芯片对相关靶组织进行检测，建立肿瘤发生的不同阶段相关靶组织的疾病-正常基因表达差异谱，为全面认识肿瘤，发现新的病理机制提供依据。（3）建立药物-对照基因表达差异谱：有根据地选择一系列中药单体化合物、单味中药和中药复方，设立低、中、高3个剂量组和正常对照组，观察其在肿瘤发生的不同阶段中对肿瘤的相关靶组织基因表达的影响，建立药物-对照基因表达差异谱，用于中药抗肿瘤药物的筛选。

采用高通量基因芯片筛选方法快速筛选出有效成分，并快速完成药理学试验，利用计算机分析各种成分间相互作用关系，绘制出中药复杂成分间相互作用的图谱，观察它们对基因表达的影响，对认识中药作用的靶基因，阐明抗肿瘤中药的作用机制、毒副作用、作用新靶点及药物筛选是非常有效的手段，可大大加快中药现代化进程。

3 基因芯片存在的缺陷

基因芯片已广泛应用于人体肿瘤分析，其高速度、高效率和大信息量的特点远优于传统基因分析法。但基因芯片在肿瘤研究中也有缺点，如Northern杂交出的差异表达基因经microarray筛选有可能漏检；另外DNA芯片上原位合成探针难免有错误核苷酸掺入及混入杂质，使整个杂交背景增高，降低特异性。可见，如何排除这些无关基因的影响也是一个目前研究的重要课题。

基因芯片技术是一种非常行之有效的手段，但如何正确地分析所得的大量信息存在一定的困难，主要是缺乏足够的生物信息学知识支持。此外，细胞行使功能的是蛋白质等成分，由DNA到mRNA再到蛋白质这个基因表达的全过程有许多的调控因素，仅仅明白其中的一段是远远不够全面的。而在许多情况下，细胞内mRNA的含量并不与细胞内相应蛋白质的含量相关；蛋白质只需要经过磷酸化/去磷酸化等简单的修饰，就可以极大地改变活性，而基因表达的变化则受到许多复杂因素的影响。

4 结语

近年来，分子生物学知识和技术突飞猛进，取得了巨大成就，为生命科学领域注入了新的活力。分子生物学是从微观的分子水平研究生命，这与以“整体观念”为指导思想的中医药学存在极大的差异。如何用中医药理论解读分子生物学技术所取得的海量数据，如何用这些数据诠释和发展中药药理学，是分子生物学与中药药理学融合的根本所在，也是难点所在。在中药药理学中应用分子生物学技术必须以中医药理论为指导，以现代中药药理学研究为基础，借鉴西药药理学现代研究思路，综合现代植物化学、分析技术，运用系统生物学知识，实现从理论到技术的系统结合。中医药理论及中药和其复方的特殊性，使得探索的过程充满艰辛，但分子生物学的引入必然引起中药药理学质的飞跃，促进中药肿瘤药理规范发展也是毋庸置疑的。只有当基因芯片同其他技术有机结合时，才能在中医药现代化这一系统工程中发挥最佳作用。

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