代谢组学方法及其在中医药中的应用

郑敏霞，沈 洁（浙江中医药大学附属第一医院，杭州市 310006）

从系统生物学的角度看，疾病是因蛋白质网络和基因调节网络被“扰动”而致，而中医中的“证候”可能是蛋白质网络和基因调节网络被“扰动”后所发生的一种特异性变化状态。这一被扰动网络可通过其分泌到血液和尿液的内源性成分的改变而反映出来，而这种改变常以组、群、谱的特征出现。因此，反映中医证候规律的“物质基础”将可能是“组”、“群”、“谱”集成的形式[1]。

1 代谢组学概念

1.1 代谢组学定义

代谢组学是一门新兴学科，指的是单个细胞、组织、器官或体液中所有小分子代谢物的集合，主要包括基因调控生物体在代谢过程中形成的中间产物和最终产物，即有机体内合成的代谢物便构成了代谢组，是关于生物体系内源代谢物质种类、数量及其变化规律的科学。它研究的是生物整体、系统或器官的内源性代谢物质及其与所受内在或外在因素影响的关系。常用的方法是检测和量化一个生物整体代谢随时间变化的规律，并对之进行编目；建立内在和外在因素影响下，代谢整体的变化轨迹，反映某种病理（生理）过程中所发生的一系列生物事件[2]。

1.2 代谢组学研究意义

与转录组学、蛋白质组学相比，代谢组学的优势在于：①一切外源性刺激（如药物、食品、环境等因素）都会促使生物体系进行调节并导致代谢组的变化，这种变化是生物过程的最终结果，生物体许多不能从转录组、蛋白质组体现出的变化可以通过代谢组体现；②代谢组学放大了基因和蛋白表达的微小变化，从而使检测更容易；③代谢组学的研究不需建立全基因组测序及大量表达序列标签（EST）的数据库，且代谢物的种类要远小于基因和蛋白的数目；④由于给定的代谢物在每个组织中都是一样的，所以研究中采用的技术更为通用也更易被人们所接受[3]，正如Billy David所言：“基因组学和蛋白质组学告诉你可能发生什么，而代谢组学则告诉你已经发生了什么”[4]。

2 代谢组学分析技术

先进的分析检测技术结合模式识别和专家系统等计算分析方法是代谢组学研究的基本方法。生物样本中代谢物种类复杂，数目众多，单一分析手段往往难以实现对样本中全部代谢产物的测定。精确、灵敏、高通量的分析方法为代谢物分析提供化学手段，是代谢组学研究的基础。各种常用的分离分析和不分离分析的手段都已经应用于代谢组学分析工作中，其中最常用的分析方法是1H核磁共振（1H-NMR）[5]和色谱（毛细管电泳）-质谱联用[6]，这两种方法各具特点，互为补充。

代谢组学是数据驱动的学科，各种模式识别的计算技术从大量的分析信号中发现有用知识或特征模式，是代谢组学研究的重要工具。海量数据要求适当的生物信息学方法进行有效信息的提取、噪声信息的剔除等处理，最终达到能够正确判断或预测生物样本的代谢模式，以及对具体代谢模式所对应的生物标志物（群）进行识别的目的。

3 代谢组学在中医药中的应用

代谢组学与中医学在许多方面有相近的属性，如果把它们有机的结合起来研究将是非常有意义的工作。代谢组学之父、英国伦敦帝国理工学院Jeremy Nicholson教授也认为人体应该作为一个完整的系统来研究，应用代谢组学和全面性系统策略来理解疾病过程，这与中医的整体观念和辨证论治思维方式不谋而合。

3.1 代谢组学与中医辨证论治

代谢组学的研究通过对某一病证相关特定组分的共性加以分析、判断，能够帮助人们更好地理解病变过程及机体内物质的代谢途径和代谢状况，同时代谢组学还有助于发现疾病的生物标记物而达到辅助临床诊断的目的。它能够通过检测不同时间患者的尿液或血液，对这些由疾病引起的代谢产物的响应进行分析，即代谢物组分析。其准确性依赖于仪器的性能，可以提高诊治的科学化、定量化，避免人为因素的误诊。Zheng X等[7]采用气相色谱-质谱（GC-MS）联用结合模式识别的代谢组学方法研究了冠心病中医临床分型的体内物质基础，其两证型间的多个内源性代谢产物的含量存在明显差异，且代谢组学的整体数据和标志物信息均显示出两证型冠心病的差异，提示代谢组学所研究的体内小分子化合物可能正是中医分型的物质基础。Lu YH等[8]采用GC-MS联用法测定健康人和原发性高血压病患者的血清内源性代谢物，结合主成分分析（PCA）和其偏最小乘方分析（PLS-DA），发现健康人和高血压病患者血清代谢物谱有明显的差异，利用马氏距离（MD）分析可以清晰的区分3种中医临床证型的高血压，同时还能显示高血压的发展过程。Li L等[9]应用NMR技术分析气虚血瘀证鼠的尿液代谢物，发现模型组在甲酸盐和肌酐等产物中与正常组存在差异。上海交通大学药学院采用代谢组学研究，发现肾阳虚模型动物的代谢网络明显偏离正常组动物，而用温阳中药干预后，模型动物的代谢谱回归至正常范围，呈现网络修复的结果[10]。“证”的研究可以和处于科学前沿、综合程度很强的系统生物学方法相结合，同时也是生命科学与临床医学的结合。这将把“证”的研究再次推向科学发展的前沿，成为中医现代化最重要的研究方向之一。

3.2 代谢组学与中医藏象理论

传统医学中的藏象学说就是研究内在的生命本质与外在现象的关系，揭示脏腑与形体诸窍、自然环境关系的学说。不同脏腑表现出来的生理现象是机体在不同环境下代谢结果的集中体现。换言之，藏象就是通过外在可见形象研究内在不可见事物的一种方法，这种研究方法与现代“黑箱理论”有相似之处[11]。代谢组学可以通过对“黑箱”外在的内源性代谢物的种类和数量的变化，与从疾病前兆到疾病发生、达到临床诊断判定标准这一进程作相关性研究，可以获得疾病前判定的科学依据，有利于对疾病进行预防和对预防效果的评价。例如偏头痛的病因病机未明，一直以来有血管舒缩异常学说、神经机能障碍学说、三叉神经血管假说等，但是偏头痛患者在先兆期和发病期都会出现前列腺素、神经肽等一系列内源性物质的异常[12]，代谢组学可以通过对这一系列的内源性物质的监控达到预防疾病的目的。

3.3 代谢组学与中药方剂的整体疗效

疾病是系统化、动态化、整体化的过程，在治疗时应随疾病的进程不同而调整药物剂量，甚至药物的种类，而以单一成分作用到单靶点的西药对此束手无策，因为疾病发生的不同阶段需要不同的药物组分发挥调节作用，复方药或多组分药将在疾病治疗中担当重要角色。Wei YJ等[13]采用LC-ESI-MS法进行了复方丹参制剂体内代谢组学研究，分析测定了14种皂苷、13种酚酸和9种醌类化合物，而且检测了口服该药后鼠血浆、尿液和粪便中的53种代谢产物，包括30种原型化合物和23种转化后的化合物，并且得到了复方丹参制剂中几种成分的代谢途径，揭示了该复方制剂的体内过程和活性物质基础。四君子汤在临床上可以治疗腹泻和便秘，这种可治疗截然相反的两个疾病的方剂使用在西医里是不可思议的。其实中医用它来主治脾胃气虚证，而脾胃气虚证可以理解成导致代谢网络产生特定的损伤或破坏，这种损伤的两个“极端”的结果就是腹泻和便秘，四君子汤的使用一旦“方证对应”，就可以通过多种成分、多层次、多靶点地对“网络性”损伤进行修复，从而达到治疗疾病（甚至是相反疾病的）的效果。中药（尤其是复方）的整体性作用机制和疗效在系统代谢组学的研究方法中，将可能得到充分的展示和挖掘。

3.4 代谢组学在中药现代化方面的应用

植物代谢物是中药的活性成分，其种类和含量随品种、生长环境、采集季节以及炮制方法等因素而变化。因此，中药的质量问题主要就是植物代谢组的问题，而药理和毒理则是药物对服药者内分泌（代谢组）的影响。

3.4.1 代谢组学与中药现代基础研究 代谢组学研究可对各原料药有效成分进行动态监测，从而克服采用不同原料药材的中药成品质量不稳定的弊端。同一药材的多基源情况使中药或中成药品种多而复杂，成分极不稳定，最终影响成品中药的标准化推广[14]。Wang M等[15]研究了采摘时间对银杏叶代谢产物的影响，在相同的条件（土壤、压力和气候条件）下，分别在清晨和晚上采摘银杏叶，用甲醇提取叶中存在的代谢产物，如银杏内酯、白果内酯和黄酮类物质，并用薄层色谱法分析。结果显示，采摘时间虽只有一段时间的间隔，但其银杏内酯和白果内酯的含量却有较明显的增长，不仅是含量高低而且代谢产物的组成数量也受采摘时间的影响，这种效应对黄酮类物质的影响最明显。所以，应用代谢组学研究方法对道地药材进行指纹图谱水平鉴别，是严格控制中药原药材质量的关键技术环节之一。现代中药系统研究的指导思想必须符合多成分、多靶点、整体调节的中医药基本思想，又能以现代技术进行有效的科学表征，建立基于代谢组学思想的化学分析平台得出的中药组分的各种指纹化图谱（数据库）[16]，并以此作为通用的准则抢占国际标准的制高点，这应是中药现代研究的一个基本突破口。

3.4.2 代谢组学与中药现代临床研究 充分利用代谢组学技术建立新的中药研发模式，其中心任务是建立考虑共生菌群代谢作用和CYP450代谢特性的新研发平台，构建带有人体菌群或代谢酶系的动物模型，实现宿主遗传特性和菌群及酶系结构的标准化，通过对体液和组织的代谢组学特征开展研究，准确评价中药的药理药效，建立相应的标准和操作规范，有助于临床合理用药和预防疾病，从而为中药代谢机制和研发技术的标准化研究奠定基础[17]。

中药毒理涉及药物毒性损害的剂量、药效毒性安全比、毒性作用靶器官、毒性作用持续时间、积蓄毒性及药物结构与毒性强弱关系、区别中药自身原因引起的不良反应和非中药自身原因引起的毒性反应等多项内容。以马兜铃酸引起的肾毒性为例，从病理研究结果来看，可能是马兜铃酸引起肾间质炎性细胞浸润和成纤维细胞聚集，并分泌大量细胞基质所致。但这未能阐明马兜铃酸毒性的物质基础，也就无法确定并去除毒性组分。而代谢组学却能从整体图谱水平上阐明中药对机体所形成的内源性代谢影响和外源性代谢毒性影响，以及生物标志物的变化规律。刘霞等[18]采用1H-NMR代谢组学方法分析马兜铃酸Ⅰ诱导的雄性小鼠急性肾毒性。结果表明，马兜铃酸Ⅰ诱导的急性肾毒性主要来自给药后抑制了小鼠体内的三羧酸循环和能量代谢，破坏了体内肠道菌群的生态平衡，改变了肾脏细胞内外的渗透压，从而引起肾小管损伤。这项基于1H-NMR代谢组学方法的研究有可能为药物的毒性机制研究提供新的思路。

3.4.3 运用代谢组学构建中药标准研究模型的作用 代谢组学作为一种系统方法，能在鉴别和确证药理与疾病模型上发挥作用。成功的疾病治疗必须使代谢网络中的缺陷部分正常化而不干扰其他维持健康所必须的代谢途径的调控。代谢组学图谱能全面反映代谢网络途径的大量化合物，区别不同种属、不同品系动物模型的代谢状态，鉴别人体疾病状态的差异，寻找人类疾病、药效和毒性的适宜动物模型，最终给出新药的药理药效和人体毒理方面的综合数据。

中药作用机制的研究主要是研究药物在代谢调控中所起的作用和如何起作用。这正符合了代谢组学全面而数学化的特点。体内药物代谢的指纹图谱，不仅可研究药物本身的代谢变化，更重要的是可研究药物引起的内源性代谢物的变化，从而直接反映体内生物化学过程和状态的变化；并通过认识体液“代谢指纹图谱”的变化，寻找或阐明药物的作用靶点或受体。Wang P等[19]筛选和分析了当归补血煎剂吸收入血的成分及其代谢产物，建立了代谢指纹图谱，能够快速筛选出多种活性成分和代谢产物，很好地解释了当归补血煎剂的作用机制。Li F等[20]采用超高效液相色谱-质谱结合多元统计分析方法对淫羊藿的药效物质组学及其对氢化可的松诱导肾虚证大鼠的代谢物谱的影响进行了初步研究，通过比较正常组、模型组及淫羊藿醇提取物给药组大鼠的血清和尿样的代谢谱，发现淫羊藿苷和朝霍定C可能为淫羊藿的主要药效物质基础，进而对大鼠体内基础代谢物谱、肾阳虚大鼠代谢物谱及给药淫羊藿后大鼠体内代谢物谱进行比较研究，寻找与肾阳虚大鼠相关的生物标记物，发现淫羊藿可使肾阳虚大鼠网络得以修复，由此探讨了淫羊藿补肾的作用机制。目前，受体学说已经成为现代医学科学的重要理论，在神经冲动传递过程中的化学递质传送研究中，应用代谢组学方法可测定给药动物血清中多种内源性神经递质（Ach、DA、NE、5-TH等）的动态变化，从代谢组分及体内代谢过程中代谢物含量变化的实时监测中发现具有疗效的生物活性标志物，从中发现中药的某些作用和起效机制[21]。

4 结语

如果能用整体性思路的代谢组学技术与中医的整体观念进行有效组合，一定能进一步加快中医药学研究的现代化进程。如果将系统生物学方法“导入”中医的“证本质”及“藏象、病机”和复方中药多层次、多靶点治疗的协同性和方剂对应性的整体性研究领域，将有可能探索出循证中医学研究的新方法与新途径，有望在中医药基础和临床研究的思路与方法上有所创新，中医药与以代谢组学为核心的系统生物学的结合将是一个极富创造性，并可能引领中医药现代化的重要之举。

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