蟾酥提取物微球制备及含量的测定

苏丽英 刘国实 张泽兵 周小洲 王 澜 韩 冰 才子斌

(武警吉林省总队医院口腔科，吉林 长春 130061)

聚乳酸-羟基乙酸共聚物〔Poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA〕是近几年来常被应用于控释、缓释给药系统的载体材料。微球(microspheres)是一种药物包裹于适宜的高分子材料或吸附于适宜的载体材料而制备的类球状或球状的微粒。蟾酥(Bufobufo gargarizans C antor)是我国传统中药，其性温，味甘辛，有毒;具有消肿、止痛、开窍、醒神、解毒、强心等效用〔1〕。蟾酥中含有多种有效的化学成分，包括蟾毒色胺类和蟾毒配基类化合物，以及从蟾蜍中分离而得到的肾上腺素、吗啡、多糖类和蝶啶类等化合物〔2〕。近几年来临床医学和药学的进一步研究表明蟾酥还具有抗肿瘤、抗老年痴呆、降血压、抗炎和麻醉等多种药理学作用〔3〕。在PLGA中将蟾蜍的提取物包裹于其中而制备成微球。这种微球是具有长效作用机制的贮库式的可生物降解的微球，不仅能够明显地提高患者的耐受性和依从性，同时也能够提高药物的生物利用度和生物学稳定性。

1 资料与方法

1.1 材料 蟾酥购于吉林大药房(经吉林大学药学院鉴定为蟾酥Bufobufo gargarizans C antor)。蟾毒灵对照品，华蟾毒配基对照品(中国药品生物制品检定所提供)。RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，SHIMADZU LC-10AVP高效液相色谱仪(日本)，AB204-N电子天平(Mettler公司)。所用化学试剂均为分析纯(北京化学试剂厂)。

1.2 方法

1.2.1 采用复乳溶剂挥发法制备蟾酥提取物蟾毒灵和华蟾毒配基微球 精密称取蟾酥提取物蟾毒灵和华蟾配基200 mg，将其溶于水制备成溶液。向浓度范围25%～32%的PLGA的二氯甲烷的溶液中，加入浓度为1 200%～1 800%的蟾毒灵和华蟾毒配基的高浓度的水溶液，将其进行高速搅拌从而制成油包水的初乳，向溶有浓度为0.9% ～1.1%的PVA的0℃的水溶液中缓慢注入前述已制备好的初乳。使用自制复乳搅拌反应器进行高转速搅拌，从而形成水包油包水的复乳。再以低转速搅拌，利用真空泵在搅拌期间向反应器中进气，同时在反应器内使用抽风机由内向外排气，3 h之后即可得到固化的微球。用蒸馏水将所得微球冲洗5次，再使用辅料溶剂(7%甘露醇和1%羧甲基纤维素钠)将所得微球继续冲洗2次。微球粉末是微球中加入50 ml的辅料溶剂，再经冷冻干燥而制得。将冻干的微球粉末通过滤网 (154 μm)，在4℃环境中保存。

1.2.2 微球形态学测定及蟾酥提取物蟾毒灵和华蟾毒配基的PLGA微球包封率的测定 将蟾酥的提取物蟾毒灵及华蟾毒配基的PLGA微球 (制备后未加其他辅料)混匀后，在离心管中加入二氯甲烷2 ml以溶解精密称取的30 mg蟾酥的提取物蟾毒灵和华蟾毒配基的PLGA微球，将管口密封，待二氯甲烷溶解微球后，再将醋酸缓冲液1 ml滴加于管中，将管口密封，在振荡器上将离心管振荡10 min，在低速离心机上调整转速为3 000 r/min，将离心管离心10 min。向另一支试管中加入吸取的上层清液，以及醋酸缓冲液1 ml，将管口密封，将试管在振荡器上振荡，再在离心机上离心，吸取上层清液再置于另一试管中。将上述操作重复6次，最后将水加入至试管中定容至6 ml，应用高效液相色谱法检测需量取70 μl，从而折算包封率。蟾酥的提取物蟾毒灵及华蟾毒配基的微球称取30 mg以进行粒径检测，并通过电镜及显微镜进行形态学的观察。

1.2.3 色谱条件 为检测在微球中蟾毒灵和华蟾毒配基的含量，利用高效液相色谱对有机试剂萃取后的溶液进行检测，ODSC18柱 (250×4.6 mm，5 cm);检测波长:296 nm;流动相:乙腈∶0.5%磷酸二氢钾 (KH2PO4)溶液为32∶68(用磷酸调pH3.2);流速为1 ml/min;柱温:40℃;理论板数按蟾毒灵色谱峰、华蟾毒配基色谱峰计算均不应低于4 000。

1.2.4 制备供试品溶液 取约0.2 g的待测样品，精密称定，加入精密量取的40 ml甲醇，将其重量精密称定，加热回流2 h，冷却至室温，再称其重量，为补足减失的重量向其中加适量甲醇，混匀。过滤 (0.45 μm微孔滤膜)后，供试品溶液即为其中10 ml的续滤液。分别取供试品溶液、蟾毒灵溶液、华蟾毒配基溶液注入液相色谱仪中，测定、记录蟾毒灵和华蟾毒配基的保留时间分别为113 min和106 min，理论板数按蟾毒灵峰计算为4 000，按华蟾毒配基峰计算为4 100〔4～6〕。其他峰和蟾毒灵峰、华蟾毒配基峰的分离度 ＞1.5。

2 结果

蟾毒灵和华蟾毒配基的PLGA微球制剂呈粉末状，白色，微球为致密、圆整的球状，既无萎缩也无塌陷的现象。其中制备微球粒径大小适宜，经测量其范围200 nm～10 μm。微球制剂的包封率较高，该微球制剂的包封率经测量可达70%以上。为满足肌肉注射的要求其粒径大小、包封率均符合要求。

为保证峰面积与进样量呈现良好的线性关系，蟾毒灵的进样量范围为0.206～1.03 g。每间隔4 h测定同一供试品溶液一次，分别测定、记录蟾毒灵与华蟾毒配基的峰面积，再分别计算出两者的相对标准偏差 (RSD)。数据结果显示两者RSD值均不大于3%，符合规定要求。同一批样品取6份，依前述的方法进行平行试验，测定结果表明两者的重现性较好。为考察其稳定性，同一供试品溶液等体积量取6份，分别放置4、8、12、16、20、24 h后进样，分别测定、记录蟾毒灵与华蟾毒配基的含量。测定结果显示两者的RSD值均不大于3%。稳定性试验结果表明至少在24 h内供试品溶液性质稳定。

3 讨论

目前制备药物PLGA微球最常用的工艺是复乳搅拌挥发法，由于蟾毒灵与华蟾毒配基两个蟾酥提取物易溶于水，因此本文制备蟾毒灵与华蟾毒配基的蟾酥提取物微球采用w/o/w的方法。复乳搅拌挥发法的优点是技术路线简单易行，但是缺点是影响制备工艺的因素较多，其中包括油水的比例、PLGA的浓度、初乳及复乳的速度、内水相的体积以及搅拌装置等。在蟾酥提取物蟾毒灵与华蟾毒配基微球的制备中诺华制药采用的是喷雾干燥法。干燥法制备的微球优点是均一性良好，能够一步成球，微球无需再进行后处理，适合较大规模的工业生产;然而经复乳搅拌挥发法制备的蟾毒灵和华蟾毒配基的蟾酥提取物微球的优势体现在药物的释放上。将工艺参数控制好，并保证操作无菌，复乳搅拌挥发法同样能够放大生产。

由于蟾酥中成分的组成及结构复杂，迄今为止对蟾酥中包含的所有成分尚未研究明确，现有研究成果显示蟾酥中约20%是脂溶性成分，其中主要为蟾蜍毒素类包括蟾毒配基类及其酯〔7〕。蟾毒配基类 (bu fogeinins)一般是蟾蜍毒素类化合物等原成分经过提取或者干燥加工过程分解而得到的，其原因可能是蟾蜍毒素在蟾酥的炮制及加工过程中分解而成。蟾毒配基类的种类约有20多种，其中主要包括华蟾毒配基、脂蟾毒配基、蟾毒灵、远华蟾毒精、日蟾毒它灵、蟾毒它灵等化合物。随着对蟾酥的临床作用、药理学及药效学研究的不断深入，众多学者日益重视和研究提取分离蟾酥中的有效成分。本文系统地研究了蟾毒灵和华蟾毒配基这两个的蟾酥中有效成分的含量，并为缓控释制剂的应用而制备相应的微球，为蟾酥中有效成分蟾毒灵和华蟾毒配基在微球制剂的检测以及蟾酥在临床应用、药理学和药效学等方面的研究提供了新的实验依据，并为研制和开发蟾酥相关的缓控释制剂提供了实验和理论基础。

1 苏永华，牛 欣.蟾酥制剂的药效作用研究评述〔J〕.北京中医药大学学报，2001;24(2):51-4.

2 刘 冬，杜守颖，何秀峰，等.蟾酥中3种脂溶性有效成分提取工艺及含量测定方法〔J〕.中国实验方剂学杂志，2011;17(3):69-72.

3 曹徐涛.蟾皮的化学成分研究〔D〕.沈阳药科大学硕士论文，2009;10(S1).

4 刘 丹，奉建芳.蟾酥中3种蟾毒配基组合物的表观溶解度和表观油水分配系数的测定〔J〕.中国中药杂志，2008;33(11):1256-8.

5 钮亚珍，薛贵平.蟾酥的药理作用研究进展〔J〕.张家口医学院学报，2002;19(3):58-9.

6 王浩天，王 爽，王海龙.蟾酥提取物华蟾毒配基和蟾毒灵含量测定〔J〕.人参研究，2008;1:29-31.

7 刘吉华，王静蓉，余伯阳.反相高效液相色谱法测定蟾酥中的3种蟾毒内酯〔J〕.色谱，2008;26(2):186-8.