骨髓瘤细胞抑制成骨细胞活性和Runx2表达

郑晓强 陈君敏 (福建医科大学附属第一医院血液科，福建 福州 350000)

目前研究表明，骨髓瘤骨病(MBD)患者的OB存在发育障碍〔1〕，具体机制尚不明确。Runx2是调控OB发育的关键因子〔2〕，其是否参与MM骨形成障碍的机制，国内尚未见有报道。本文建立骨髓瘤细胞株和MSCs共培养体系，研究骨髓瘤细胞对MSCs生物特性和Runx2表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 MM细胞系U266细胞株由福建医科大学附属协和医院血液病研究所馈赠，L-DMEM培养基干粉、PBS粉剂、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)，人淋巴细胞分离液(上海试剂二厂，比重1.077±0.001)，新生胎牛血清、青链霉素(Hyclone公司)，地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素 C(美国 Sigma公司)，BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(碧云天生物技术研究所)，引物合成(上海生工)，Trizol液(Tri Reagent公司)，cDNA第一链合成试剂盒(Fermentas公司)，聚合酶链反应试剂、标记物、焦碳酸二乙酯、PCR Master Mix、琼脂糖(厦门泰京生物工程有限公司)，异丙醇、氯仿，无水乙醇、多聚甲醛、中性红、硝酸银、硫代硫酸钠(上海试剂总厂)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓MSCs的培养 骨髓标本来源于2例缺铁性贫血患者和1例特发性血小板减少性紫癜患者，平均年龄(58.8±5.63)岁。抽取骨髓液5 ml，加入肝素管中，颠倒混匀防止凝固。加入等体积PBS，混匀，1 000 r/min离心5 min，去除脂肪及上清。加入等体积PBS，吹打混匀。将细胞悬液加至盛有等体积淋巴细胞分离液的离心管中，2 500 r/min离心30 min。收集中间层面云雾状单个核细胞层，L-DMEM培养液(为含10%新生胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/L链霉素的低糖DMEM)洗涤细胞，1 000 r/min离心5 min。调整细胞密度为106/ml，接种于25 cm2培养瓶，放入37℃，5%CO2培养箱。培养5 d后首次换液，以后每3天换液，每日倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。当细胞汇合到90%时(约两周)，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例传代。

1.2.2 MM细胞系(U266细胞株)的培养 MM细胞系U266细胞株由福建医科大学附属协和医院血液病研究所馈赠，在LDMEM培养液，37℃，5%CO2条件下培养。每3天换液，U266细胞株为悬浮细胞，换液和传代时，用吸管吹打培养瓶底，吸取培养液于一离心管，PBS洗涤3次，L-DMEM培养液重悬细胞，接种于培养瓶中，置入培养箱培养。U266细胞株的传代培养按 1∶2或 1∶3接种。

1.2.3 U266细胞株和MSCs共培养体系的建立 MSCs培养至3～5代，L-DMEM培养液重悬105个MSCs，接种于6孔板中，培养液定容为2 ml，待细胞60% ～70%融合时，吸净孔板中的培养液，PBS洗3次，换为含地塞米松(10－8mol/L)、维生素C(0.05 g/L)和β-甘油磷酸钠(10－2mol/L)的L-DMEM条件培养液，用条件培养液重悬U266细胞株，接种106个细胞至上述6孔板进行共培养，每3天半量换液，未加U266细胞株的MSCs培养体系作为对照组。

1.2.4 共培养体系MSCs增殖能力 L-DMEM重悬第3～5代的MSCs，接种4 000～10 000个细胞至96孔板，待细胞60% ～70%融合时，换为条件培养液，接种10 000个U266细胞株进行干预，未加入U266细胞株的MSCs作为平行对照组，分别在第1～7天进行测定，按照CCK-8试剂盒说明书每隔24 h测量1板，连续测量7 d。测量步骤:吸净孔板中培养液，增设1孔未接种细胞的孔调零，每孔加入100 μl无血清培养基和10 μl CCK-8溶液，置于37℃，5%CO2培养箱孵育2 h，在酶标仪450 nm处读取OD值，打印数据。

1.2.5 共培养体系MSCs的OB形成能力 将培养至第3～5代MSCs接种105个细胞至放有载玻片的六孔板，每3天完全培养液换液，待细胞60% ～70%融合时，换为条件培养液，接种106个U266细胞株进行干预，未加入U266细胞株为对照组，每隔3 d条件培养液半量换液，于第14天和第28天分别进行ALP和Von Kossa染色。

1.2.6 共培养体系MSCs的Runx2的表达 将培养至第3～5代MSCs接种106个细胞至六孔板，每3天完全培养液换液，待细胞80%融合时，换为条件培养液，接种106个U266细胞株进行干预，未加入U266细胞株为对照组，72 h后，采用RT-PCR法检测Runx2的表达，RT-PCR操作步骤:收集1×106个细胞置于一EP管，细胞总RNA提取及逆转录按试剂盒说明书进行操作。放置PCR仪进行扩增，引物序列如下:Runx2引物:上游:5'-TGCTGGAGTGATGTGGTTTTCT-3'，下游:5'-CCCCTGTTGTGTTGTTTGGTAA-3'，扩增片段长度为276 bp。内参GAPDH引物:上游:5'-ACCACAGTCCATGCCATCA-3'，下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，扩增片段长度450 bp。扩增条件:94℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，52℃退火 50 s，72℃延伸1 min，35个循环后72℃延长10 min。取10 PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，电压为110 V，电流与电压相对应，时间为40 min，缓冲液为0.5×TAE，指示剂为溴酚蓝，凝胶成像自动分析仪下照相，并计算Runx2/GAPDH的平均光密度值。

2 结果

2.1 共培养组MSCs的增殖能力 U266细胞株和MSCs共培养3 d，与对照组相比，细胞增殖无明显差异，AOD值分别为0.731±0.020和0.805±0.152，二者无差异(P＞0.05)，至第6天，共培养组和对照组的 AOD值分别为0.560±0.034和2.283±0.145，差异显著(P＜0.01)。

2.2 共培养组MSCs的OB形成能力 U266细胞株和MSCs在条件培养液诱导下共培养14 d，ALP染色结果显示，共培养组ALP表达明显低于对照组(P＜0.05)，IOD sum/Area sum值分别为0.138±0.038和0.376±0.044，诱导28 d，Von-Kossa染色显示，共培养组钙结节个数明显少于对照组(P＜0.01)，平均钙结节个数分别为(6.7±2.75)个和(15.3±8.99)个。

2.3 共培养组MSCs Runx2的表达 共培养组和对照组MSCs诱导72 h后，采用RT-PCR技术检测Runx2 mRNA的表达量，结果显示，共培养组MSCs Runx2的表达明显低于对照组(P＜0.01)，Runx2/GAPDH平均光密度值分别为0.238±0.168和0.653±0.343。

3 讨论

MM患者中存在OB发育障碍近年受到广泛关注。组织形态学发现，与正常人相比，MM患者OB数量减少，功能下降。造成MM患者OB发育障碍的机制还不清楚，可能的是，骨髓瘤细胞在其中起着重要作用，为此，作者根据MM细胞系U266细胞株在体外培养属悬浮生长型细胞、MSCs为贴附生长型细胞、两者在L-DMEM培养液体系均能正常生长这些特点，建立U266细胞株和MSCs的共培养体系，研究骨髓瘤细胞是否影响MSCs的增殖及其向OB分化的能力，结果表明骨髓瘤细胞存在时正常MSCs的增殖及OB形成能力均降低。

骨髓瘤细胞抑制MSCs增殖和OB形成能力其确切的机制还不明了，可能与骨髓瘤细胞表达的某些抑制细胞因子与OB的发育有密切关系，Runx2是OB分化的特异性标志，在OB发育过程起重要作用，骨组织活检的结果表明，与患有MM但未进展为骨病的患者相比，MBD患者Runx2阳性细胞的数量明显减少〔3〕。体外实验也证实，骨髓瘤细胞可抑制Runx2基因的活性〔4〕，本文研究结果表明，U266细胞株和MSCs共培养72 h时，MSCs Runx2的表达下降。这一观点也有其他研究证据的支持。Bataille等对骨组织用形态计量学分析的结果表明，MM患者Runx2表达明显低于正常人〔3〕。Prince等〔5〕研究认为，MSCs向OB分化过程中，Runx2的表达与OB形成能力呈正相关，可调节OB成熟标志物ALP、降钙素和I型胶原的表达。除此之外，Runx2动力模型实验也证实OB的形成和Runx2的表达呈正相关〔2，5〕。骨髓瘤细胞抑制MSCs Runx2表达的机制还有待研究，目前还没有充分的事实表明抑制OB发育的因子(DKK1、sFRP-2、IL-3和IL-7等)与Runx2的降低有相关性，但有研究认为，MM患者MSCs的Runx2表达的降低可能与细胞表面黏附分子VLA-4整合素和血管内皮黏附分子-1(VCAM-1)有关〔6，7〕。因此有理由认为，骨髓瘤细胞抑制MSCs Runx2的表达更可能的机制是通过细胞与细胞间的直接接触所造成的，这些都需要进一步的研究。

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5 Prince M，Banerjee C，Javed A，et al.Expression and regulation of Runx2/Cbfa1 and osteoblast phenotypic markers during the growth and differentiation of human osteoblasts〔J〕.J Cell Biochem，2001;80(4):424-40.

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