小克银汉霉属微生物模型在体外药物代谢研究中的应用

任丽艳，关 瑾，陈 星，王慧泽

(沈阳化工大学应用化学学院，辽宁 沈阳 110142)

药物代谢即药物的生物转化，是指药物在生物体内发生的有机化学反应，主要是指“脱毒”反应。药物经代谢后通常发生结构变化，从而引起相应的药理活性及毒性改变。通过药物代谢研究，可以阐明药物代谢产物的结构，确定药物生物转化过程的代谢酶，评价母体药物和代谢产物的药理学、药代动力学和毒理学性质等，为进一步改造药物的化学结构，开发新药提供依据和研究思路［1-2］。

目前药物代谢研究主要有体内和体外2种方法。体内代谢法可以综合考虑各种体内因素对药物的影响，能够真实全面地反映药物代谢的体内特征。体外代谢法可在短时间内得到大量的代谢产物，可以方便控制代谢条件，易于对代谢产物进行分离和提取，尽快确定代谢途径及结构变化［3］。目前常用的体外代谢方法主要有肝细胞培养法、肝组织切片法、肝灌流法和肝微粒法。这些方法操作繁琐，技术要求较高［4-6］。另外，随着分子生物学技术的发展，可利用基因重组表达的细胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)酶系中的某个纯酶进行药物代谢研究，但目前各种纯酶的商品价格非常昂贵，在一定程度上限制了重组药物代谢酶的应用［7］。利用微生物转化为药物体外代谢模型则具有很多优势，本文对其在药物代谢方面的应用进行综述。

1 模拟哺乳动物药物代谢的微生物模型

1973年，Smith等［8］通过实验最先提出了“建立模拟哺乳动物代谢的微生物模型(microbial models of mammalian metabolism)”的概念，其核心内容是:真菌和哺乳动物均为真核生物，因此它们在某些生化反应中有类似的酶或酶系参与。基于这一理论，利用微生物作为模型研究哺乳动物的药物代谢得到了广泛的应用。

与药物代谢的体内和体外研究方法相比较，利用微生物作为药物代谢研究的模型具有很多优势［9］:①通常情况下微生物和人体代谢途径的相似性并不亚于哺乳动物和人，因此可以采用微生物模型模拟人体药物代谢，推测或辅助证实哺乳动物体内的药物代谢途径，从而大量减少实验动物和实验成本。②微生物来源广泛，种类繁多，可提供大量的筛选模型。③可调节，通过优化条件，可显著提高目的代谢产物的收率，有助于检测和制备毫克级甚至纳克级代谢产物对照品并进行药理学与毒理学研究。④建立微生物转化系统，成本低，操作简单，易于控制。Foster等［10］研究发现，奎尼丁和金雀花碱抑制班氏小克银汉霉(Cunninghamella bainier)对普罗帕酮及甲氧那明(甲氧苯丙甲胺)的转化，与人体内的代谢过程十分类似，提示真菌中具有与人体类似的药物代谢酶，并且可以用于药物间相互作用的研究。Davila等［11］通过研究刺孢小克银汉霉(Cun.echinulata)对罂粟碱的转化发现，利用该菌株可以评价药物的毒性。Asha等［12］对各类细胞色素酶进行了介绍并对其各自作用的底物进行了总结，以真核微生物小克银汉霉属(Cunninghamella Matruchot)为例提出了微生物技术手段在未来的应用。这些研究结果表明真菌模型在药物代谢研究中具有更为广泛的用途。

2 真菌细胞色素P450

1958 年，Klingenberg［13］和 Garfinkel［14］首次发现一种能与一氧化碳结合的色素，Omura等［15］发现它是一种性质特殊的血红蛋白，其还原态可与一氧化碳结合，在波长450 nm处有明显吸收峰，因而于1962年首先提出CYP450这一名称，又称其为混合功能氧化酶(mixed function oxidase，MFO)或单加氧酶(monooxygenase)。后陆续发现CYPs是参与外源化合物解毒和内源化合物代谢的重要酶系，主要位于细胞内质网膜上，和药物代谢的Ⅰ相反应，和大部分临床药物的代谢。

真菌，尤其是丝状真菌对许多药物的转化反应都是由CYP450介导的，通过使用一些经典的CYP酶抑制剂，如美替拉酮或一氧化碳等对转化反应的抑制作用，已经间接证明了微生物和(或)真菌CYP酶参与了转化反应［16-17］。小克银汉霉属是一类丝状真菌，根据形态及生理特征共分为5种:刺孢(短刺)小克银汉霉，班氏小克银汉霉，布氏小克银汉霉，巴西果小克银汉霉和绮丽(雅致)小克银汉霉。Amadio等［18］以氟比洛芬(flurbiprofen)为底物对小克银汉霉属不同种类进行了考察，结果表明小克银汉霉属具有与人体类似的药物代谢酶。Wang等［19］利用真菌线粒体的单克隆抗体从雅致小克银汉霉的cDNA文库中筛选编码473个氨基酸残基的全长cDNA，并利用E.coli实现了过量表达，免疫印迹实验表明哺乳动物CYP1A，CYP2E1和CYP3A1的抗体与表达蛋白呈阳性反应，这些研究从另一个角度说明该菌株具有与人体十分类似的CYP450。

3 小克银汉霉属微生物模型在体外药物代谢中的应用

小克银汉霉菌属的许多菌株具有与人体类似的Ⅰ相和Ⅱ相药物代谢酶［20］，在模拟人体的药物代谢研究方面得到广泛的应用。以下以几种常用的小克银汉霉属微生物模型为例，介绍其在体外药物代谢中的一些应用。

3.1 短刺小克银汉霉属AS3.153模型在药物代谢中的应用

哈尔明碱(harmine)具有抗肿瘤作用，但其毒性较大，中毒剂量和最大安全剂量接近，因此有必要对哈尔明碱及其代谢产物的活性和毒性等方面进行研究，以探索能否找到增加其生物活性同时降低毒性的产物。邱彬等［21］应用短刺小克银汉霉(Cun.blakesleeane)AS3.153对哈尔明碱的代谢转换进行了实验。结果表明，该菌株对哈尔明碱的代谢转化率高，能够特异性地制备哈尔明碱的氧去甲基化产物和芳环上的羟基化产物，并进行了结构鉴定。到目前为止，有关哈尔明碱在人体或动物的代谢转化的报道较少，且由于通过体内代谢得到的产物量少，难以进行下一步研究。而药物微生物转化有利于制备足量的代谢产物，为进一步的药物结构鉴定及其药理毒理研究奠定基础。由于短刺小克银汉霉AS3.153在药物代谢过程中转化率高，故其微生物代谢模型广泛应用于药物。目前已应用该微生物模型进行代谢研究的药物有:维拉帕米［22］、昂丹司琼［23］、苯丙哌林［24］、萘普生［25］、异戊他定［26］、泮托拉唑［27］、美托洛尔［28］和右美沙芬［29］等。

3.2 短刺小克银汉霉AS3.910模型在药物代谢中的应用

“马兜铃酸肾病”是近几年来在国际上引起广泛关注的一类由于中草药的不良反应而导致肾损害。由于马兜铃酸类化合物在体内代谢比较复杂，代谢产物又难以收集，给这类化合物代谢物的毒理学研究造成了很大的障碍。郭永超等［30］选用短刺小克银汉霉AS3.910用微生物转化的方法对马兜铃酸A进行了代谢转化研究并比较了微生物转化产物和哺乳动物体内代谢产物的异同。短刺小克银汉霉AS3.910可对马兜铃酸A进行专一性的氧去甲基化作用的结构改造而获得代谢产物，在与Krumbiegel等［31］进行的动物体内代谢产物进行比较后，证明该化合物是马兜铃酸A在哺乳动物体内代谢产物之一。经过转化条件的优化，可以稳定、方便地获得这一目标代谢物，作为标准品，从而方便了对该目标代谢物的制备及其毒理和药理学方面的研究。杨秀伟等［32］用短刺小克银汉霉AS3.910建立了具有CYP2C9活性的微生物模型。通过调节转化培养基的种类和初始pH，使转化系统在较高底物浓度下具有良好的转化效果，格列本脲、双氯芬酸和吲哚美辛总转化率分别为90%，100%和83%，而且形成的主要转化产物与人体CYP2C9产生的主要代谢产物相同。

3.3 雅致小克银汉霉AS3.156模型在药物代谢中的应用

萘普生是常用的非甾体类抗炎药物，用于治疗风湿或某些非风湿性疾病引起的疼痛与炎症。该药在人体和动物体内的代谢途径主要包括:①萘环C-6位甲氧基发生去甲基反应生成O-去甲基萘普生;② 母体药物通过羧基与葡萄糖醛酸或甘氨酸结合;③ O-去甲基萘普生通过酚羟基与葡萄糖醛酸结合［33］。刘磊等［34］采用雅致小克银汉霉(Cun.elegans)AS3.156对萘普生的微生物转化进行了研究。雅致小克银汉霉AS3.156可高度专一性地转化萘普生形成O-去甲基萘普生，且产率高达95%以上。

4 展望

小克银汉霉属的许多菌株具有与人体类似的Ⅰ相和Ⅱ相药物代谢酶，现在已应用于体外药物代谢研究中。微生物转化法具有易调节、易放大等特点，通过选择比较理想的转化菌株和优化调节可以强化某些转化途径，用于较大规模地制备一定数量的代谢物纯品，确定其化学结构与生物学活性，为体内药物代谢产物的深入研究奠定实验基础。但由于其尚不能全面反映体内代谢的综合情况，与生物体内的真实情况存在一定的差异及菌株成本较高，使得这种方法制备的代谢产物对照品非常昂贵，其广泛的应用受到一定的限制。

［1］钟大放.药物代谢［M］.北京:中国医药科技出版社，1996:1-14.

［2］宋振玉.药物代谢研究意义、方法、应用［M］.北京:人民卫生出版社，1990:4-8.

［3］柴士伟，潘桂湘.药物代谢研究方法简述［J］.天津中医药，2006，23(1):83-85.

［4］Wrighton SA，Ring BJ，Van denBranden M.The use of in vitro metabolism techniques in the planning and interpretation of drug safety studies［J］.Toxicol Pathol，1995，23(2):199-208.

［5］Parrish AR，Gandolfi AJ，Brendel K.Precision-cut tissue slices:applications in pharmacology and toxicology［J］.Life Sci，1995，57(21):1887-1901.

［6］Thohan S，Zurich MC，Chung H，Weiner M，Kane AS，Rosen GM.Tissue slices revisited:evaluation and development of a short-term incubation for integrated drug metabolism［J］.Drug Metab Dispos，2001，29(10):1337-1342.

［7］Guengerich FP，Parikh A.Expression of drug-metabolizing enzymes［J］.Curr Opin Biotechnol，1997，8(5):623-628.

［8］Smith RV，Rosazza JP.Microbial models of mammalian metabolism.Aromatic hydroxylation［J］.Arch Biochem Biophys，1974，161(2):551-558.

［9］Azerad R.Microbial models for drug metabolism［J］.Adv Biochem Eng Biotechnol，1999，63:169-218.

［10］Foster BC，Wilson DL，McGilveray IJ.Effect of sparteine and quinidine on the metabolism of methoxyphenamine by Cunninghamella bainieri［J］.Xenobiotica，1989，19(4):445-452.

［11］Davila JC，Hsieh GC，Acosta D，Davis PJ.Cytotoxicity induced by papaverine hydrochloride in fungal cell systems［J］.Toxicol Lett，1990，54(1):23-31.

［12］Asha S， Vidyavathi M. Cunninghamella-a microbial model for drug metabolism studies-a review［J］.Biotechnol Adv，2009，27(1):16-29.

［13］Klingenberg M.Pigments of rat liver microsomes［J］.Arch Biochem Biophys，1958，75(2):376-386.

［14］Garfinkel D.Studies on pig liver microsomes.Ⅰ.Enzymic and pigment composition of different microsomal fractions［J］.Arch Biochem Biophys，1958，77(2):493-509.

［15］Omura T，Sato R.A new cytochrome in liver microsomes［J］.J Biol Chem，1962，237:1375-1376.

［16］Yang W， Jiang T， Acosta D， Davis PJ.Microbial models of mammalian metabolism:involvement of cytochrome P450 in the N-demethylation of N-methylcarbazole by Cunninghamella echinulata［J］.Xenobiotica，1993，23(9):973-982.

［17］Zhang D， Hansen EB Jr， Deck J，Heinze TM，Henderson A，Korfmacher WA，et al.Fungal transformations of antihistamines:metabolism of cyproheptadine hydrochloride by Cunninghamella elegans［J］.Xenobiotica，1997，27(3):301-315.

［18］Amadio J，Gordon K，Murphy CD.Biotransformation of flurbiprofen by Cunninghamella species［J］.Appl Environ Microbiol，2010，76(18):6299-6303.

［19］Wang RF，Cao WW，Khan AA，Cerniglia CE.Cloning，sequencing，and expression in Escherichia coli of a cytochrome P450 gene from Cunninghamella elegans［J］.FEMS Microbiol Lett，2000，188(1):55-61.

［20］Zhang D， Yang Y， Leakey JE， Cerniglia CE.PhaseⅠ and phaseⅡenzymes produced by Cunninghamella elegans for the metabolism of xenobiotics［J］.FEMS Microbiol Lett，1996，138(2-3):221-226.

［21］邱 彬，罗文鸿.短刺小克银汉霉菌对哈尔明碱的代谢转化［J］.汕头大学医学院学报，2010，23(2):81-83.

［22］刘 磊，黄海华，孙 璐，钟大放.短刺小克银汉霉菌对维拉帕米转化的能力［J］.中国药理学与毒理学杂志，2002，16(4):292-298.

［23］李欣南，齐秀兰，段明郁，黄海华.短刺小克银汉霉与卷枝毛霉对昂丹司琼的转化［J］.微生物学杂志，2007，27(3):54-60.

［24］黄海华，崔洪霞，钟大放，杜宗敏.利用微生物转化模型研究苯丙哌林的代谢产物［J］.中国药理学与毒理学杂志，2001，15(4):297-301.

［25］Zhong DF，Sun L，Liu L，Huang HH.Microbial transformation of naproxen by Cunninghamella species［J］.Acta Pharmacol Sin，2003，24(5):442-447.

［26］于立华，黄海华，司端运，李智峰，钟大放.拟低聚氨基糖类系列化合物异戊他定的微生物转化［J］.沈阳药科大学学报，2002，19(2):129-133.

［27］谢智勇.泮托拉唑代谢和立体选择性药物动力学研究［D］.沈阳:沈阳药科大学，2005:19-21.

［28］Ma B，Huang HH，Chen XY，Sun YM，Lin LH，Zhong DF.Biotransformation of metoprolol by the fungus Cunninghamella blakesleeana［J］.Acta Pharmacol Sin，2007，28(7):1067-1074.

［29］Lin L，Huang H，Zhang P，Qi X，Zhong D.Microbial transformation of dextromethorphan by Cunninghamella blakesleeana AS 3.153［J］.Chem Pharm Bull(Tokyo)，2007，55(4):658-661.

［30］郭永超，林哲绚，罗文鸿.短刺小克银汉霉菌对马兜铃酸A的代谢转化［J］.药物生物技术，2006，13(6):451-455.

［31］Krumbiegel G， Hallensleben J， Mennicke WH， Rittmann N，Roth HJ.Studies on the metabolism of aristolochic acidsⅠ andⅡ［J］.Xenobiotica，1987，17(8):981-991.

［32］杨秀伟，黄海华，张 鹏，林立红，钟大放.建立具有药物代谢酶CYP2C9活性的微生物模型［J］.中国药学杂志，2006，41(7):551-555.

［33］Thompson GF，Collins JM.Urinary metabolic profiles for choosing test animals for chronic toxicity studies:application to naproxen［J］.J Pharm Sci，1973，62(6):937-941.

［34］刘 磊，孙 璐，黄海华，杨田英，钟大放.萘普生的微生物转化［J］.沈阳药科大学学报，2002，19(5):369-372.