高分辨率熔解曲线分析：一种新的用于遗传病基因突变筛查的技术

李东至

（广州市妇女儿童医疗中心 产前诊断中心，广东 广州 510623）

目前，DNA碱基变异如突变或单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的检测方法有2种：一是针对特定的位点合成序列特异性探针，如Taqman探针法、位点特异寡核苷酸分析、反向斑点杂交及基因芯片等，用于检测已知突变；二是以核酸的物理性质为基础的检测方法，如变性-高效液相层析、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳及构象敏感凝胶电泳等，此类方法可用作突变筛查，但无法明确突变性质。这2种方法在应用上有其局限性，如成本高、操作繁琐、耗时、以及相对低通量。DNA测序是突变／SNP检测的金标准，但不适于大规模突变筛查和流行病学研究。2002年犹他大学和爱德华科技公司合作开发出突变／SNP检测分析的一项新技术—高分辨率熔解曲线分析（high resolution melting，HRM）［1］。这种技术不受突变碱基位点与类型的限制，可同时对扩增片段进行未知突变扫描和已知突变的基因分型。因其操作简便、快速、高通量、低成本和真正实现了闭管操作而受到普遍的关注，成为近年来兴起的一种高通量突变扫描和基因分型技术。

1 HRM原理

通过PCR反应扩增出目的基因的双链DNA片段，向反应产物中加入荧光染料，这种染料只结合双链DNA而不结合单链DNA。然后通过加热物理变性，在升温的过程中DNA双链会逐渐打开，这样结合的荧光染料会越来越少。如果相机连续动态拍摄解链过程，并将接收到的逐渐减弱的荧光信号通过计算机软件转换成一条曲线，这条曲线就是熔解曲线。当PCR扩增片段存在突变／SNP时，扩增产物经过变性-陡然复性形成异源双链，异源双链中突变／SNP位点因不匹配使双链DNA在升温过程中提前解开，从而与正常样本熔解曲线区分开来。实际上，由单个碱基改变引起的解链温度差异可能不到1℃。因此，HRM需要精密度高的检测仪器，要求具有很高的温度分辨率。当仪器的温度分辨率达到0.02～0.3℃／s时，所绘制的曲线称为高分辨熔解曲线。目前使用的是饱和染料，如LC Green、LC Green Plus、SYTO 9和Eva Green，这类染料有着更强的DNA结合能力和更低的PCR抑制作用，在配制PCR反应液时就可加入，反应完毕后直接送入HRM仪进行分析，省略了PCR反应后的开盖处理步骤，真正实现了闭管操作。

2 HRM技术优点

2.1 操作简便 在PCR反应前加入一种饱和荧光染料，PCR反应后将PCR板转放在高分辨率熔解分析仪器中即可。

2.2 快速、高通量 普通PCR反应一般只需2小时，熔解分析使用HR-1仪器每个样品检测仅需1～2分钟；若使用LightScanner熔解分析仪，5分钟内可以得到96孔PCR板中的全部样品的检测结果。

2.3 低成本 比普通PCR反应仅多加一种饱和荧光染料，一般情况下每个样品成本大约2元人民币。

2.4 闭管操作 PCR扩增后直接进行HRM分析，不需要对PCR产物进行处理，减少污染机会。

3 HRM的应用

HRM的分辨率高，其敏感度和特异度均优于现有的其他突变扫描方法，适用于检测单碱基突变、小片段插入或缺失。有研究显示应用质粒来验证HRM检测单个碱基杂合突变，发现当PCR产物小于400bp时，敏感度和特异度均为100%；PCR产物长度在400～1000bp时，敏感度和特异度分别为96.1%和99.4%［2］。HRM技术现被广泛应用于突变扫描、基因分型、序列匹配、物种鉴定等。

本院实验室从2009年开始应用HRM技术，目前常规用于多种单基因病的突变筛查。α-地中海贫血是我国南方人群的常见遗传病，当夫妇的一方α-基因是东南亚缺失型（SEA）时，如果另一方携带点突变型α-地中海贫血，则下一代有1／4机会生育非缺失型血红蛋白H病患儿。这种情况下需要产前诊断，因非缺失型血红蛋白H病患儿多需要输血治疗［3］。点突变型α-地中海贫血在中国人群最常见为血红蛋白Constant Spring（Hb CS）和血红蛋白Quong Sze（Hb QS），靠一般的地中海贫血筛查方法（血常规、血红蛋白分析）无法识别，确诊需要分子诊断［4］。既往使用反向点杂交技术或直接测序技术检测Hb CS和Hb QS，现已被HRM技术替代，检测敏感性和特异性均为100%［5，6］。由于这2种点突变只占人群的0.3%，先经HRM扫描，只对熔解曲线阳性者进一步采用其他分子诊断方法证实，大大减轻了DNA测序压力。

应用HRM检测的另外一种遗传病是致死性软骨发育不良I型（thanatophoric dysplasia type 1，TD 1）。TD 1多在妊娠中晚期被产前超声检查发现，表现为长骨短小、肋骨短、胸廓狭窄等，多为新生基因突变所致。但TD 1至少需要与数十种骨骼系统发育异常的疾病相鉴别，它们在超声表现上有相似之处。TD 1是由FGFR3基因突变引起，目前至少已发现11种突变类型，其中p.R248C突变最常见，经研究发现，中国人TD 1病例几乎都检测到p.R248C突变［7］。在p.R248C突变的检测上，以往应用变性梯度凝胶电泳（DGGE）、限制性内切酶分析（RFLP）和直接测序等方法进行基因诊断。但这些突变检测方法存在操作繁琐、费用高、诊断周期长等缺点。应用HRM扫描检测p.R248C突变的敏感性和特异性均为100%［8］。因此，对常规产前超声检查疑为TD 1的病例，临床上在产前取材排除染色体疾病的同时可行基因诊断，以便尽早明确诊断，协助临床处理。HRM可用于FGFR3基因p.R248C突变的快速基因检测。

此外，还将HRM技术应用于其他遗传疾病如血友病、成骨发育不全等的突变扫描。这些致病基因往往包含数十个外显子，若采用常规DNA测序来检测基因突变，工作量和成本很大。先通过HRM突变扫描，针对异常的外显子进行测序确证，将达到事半功倍的效果。

4 HRM缺点

4.1 对PCR反应、熔解仪器、荧光染料要求较高 由于双链DNA的熔解动力学受到很多因素的影响，比如DNA模板质量、镁离子含量、缓冲液组成等，所以HRM要求DNA样品由同一种方法提取，经纯化使DNA样品浓度一致。对引物及扩增片段要求高，常需反复实验，验证是否适用于HRM。熔解仪器要求非常高的温度精密度和温度均一性。荧光染料不影响PCR反应且能饱和结合双链DNA。

4.2 突变扫描不能精确区分扩增片段中的不同杂合突变 有时不同的杂合突变导致相似的熔解曲线，需进一步经混样法区分，或小片段法、非标记探针法、Snapback探针法进行基因分型提高分辨率。

4.3 PCR扩增产物的长度受到限制 随着扩增片段的增加，其敏感性及特异性降低。

5 结论

HRM是当前最好的一种高通量突变扫描和基因分型技术。如果操作得当，可以减少95%～99%的测序工作量。HRM对PCR产物无损伤性，如果HRM鉴定样本（基因分型和序列匹配）失败，可使用原样本测序进一步鉴定，对结果无影响。可以设想，随着染料和仪器的更新，这项技术还将继续迅速发展，在医学领域发挥更多的作用。

［1］ Wittwer CT，Reed GH，Gundry CN，et al.High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen［J］.Clin Chem，2003，49：853-860.

［2］ Reed GH，Wittwer CT.Sensitivity and specificity of singlenucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis［J］.Clin Chem，2004，50：1748-1754.

［3］ Li DZ，Liao C.A case of transfusion-dependent nondeletional Hb H disease undiagnosed during prenatal screening for thalassemia［J］.Prenatal Diagnosis，2008，28：165-166.

［4］ Li DZ.Prenatal Control of Hemoglobin H Disease：is it Possible［J］？Pediatric Hematol Oncol，2011，28：86-88.

［5］ Li R，Liao C，Li D，et al.High-resolution melting analysis of the three common nondeletionalα-thalassemia mutations in the Chinese population：Hbs Constant Spring，Quong Sze and Westmead［J］.Hemoglobin，2010，34：587-593.

［6］ Liu YN，Li R，Li J，et al.Rapid identification of hemoglobin Quong Sze mutation using high-resolution melting analysis［J］.Int J Lab Hematol，2011，33（3）：5-6.

［7］ Yang Y，Li DZ.FGFR3gene mutations in Chinese cases of thanatophoric dysplasia type 1 ［J］.Fetal Diagn Ther，2009，26：90-92.

［8］ Liu YN，Li R，Li DZ.Genotyping of the C742Tmutation of the FGFR3gene causing type 1thanatophoric dysplasia by high-resolution melting analysis［J］.J Matern Fetal Neonatal Med，2011，24：186-188.