APP下载

高分辨率熔解曲线分析:一种新的用于遗传病基因突变筛查的技术

2011-02-11李东至

中国产前诊断杂志(电子版) 2011年2期
关键词:双链染料分型

李东至

(广州市妇女儿童医疗中心 产前诊断中心,广东 广州 510623)

目前,DNA碱基变异如突变或单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的检测方法有2种:一是针对特定的位点合成序列特异性探针,如Taqman探针法、位点特异寡核苷酸分析、反向斑点杂交及基因芯片等,用于检测已知突变;二是以核酸的物理性质为基础的检测方法,如变性-高效液相层析、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳及构象敏感凝胶电泳等,此类方法可用作突变筛查,但无法明确突变性质。这2种方法在应用上有其局限性,如成本高、操作繁琐、耗时、以及相对低通量。DNA测序是突变/SNP检测的金标准,但不适于大规模突变筛查和流行病学研究。2002年犹他大学和爱德华科技公司合作开发出突变/SNP检测分析的一项新技术—高分辨率熔解曲线分析(high resolution melting,HRM)[1]。这种技术不受突变碱基位点与类型的限制,可同时对扩增片段进行未知突变扫描和已知突变的基因分型。因其操作简便、快速、高通量、低成本和真正实现了闭管操作而受到普遍的关注,成为近年来兴起的一种高通量突变扫描和基因分型技术。

1 HRM原理

通过PCR反应扩增出目的基因的双链DNA片段,向反应产物中加入荧光染料,这种染料只结合双链DNA而不结合单链DNA。然后通过加热物理变性,在升温的过程中DNA双链会逐渐打开,这样结合的荧光染料会越来越少。如果相机连续动态拍摄解链过程,并将接收到的逐渐减弱的荧光信号通过计算机软件转换成一条曲线,这条曲线就是熔解曲线。当PCR扩增片段存在突变/SNP时,扩增产物经过变性-陡然复性形成异源双链,异源双链中突变/SNP位点因不匹配使双链DNA在升温过程中提前解开,从而与正常样本熔解曲线区分开来。实际上,由单个碱基改变引起的解链温度差异可能不到1℃。因此,HRM需要精密度高的检测仪器,要求具有很高的温度分辨率。当仪器的温度分辨率达到0.02~0.3℃/s时,所绘制的曲线称为高分辨熔解曲线。目前使用的是饱和染料,如LC Green、LC Green Plus、SYTO 9和Eva Green,这类染料有着更强的DNA结合能力和更低的PCR抑制作用,在配制PCR反应液时就可加入,反应完毕后直接送入HRM仪进行分析,省略了PCR反应后的开盖处理步骤,真正实现了闭管操作。

2 HRM技术优点

2.1 操作简便 在PCR反应前加入一种饱和荧光染料,PCR反应后将PCR板转放在高分辨率熔解分析仪器中即可。

2.2 快速、高通量 普通PCR反应一般只需2小时,熔解分析使用HR-1仪器每个样品检测仅需1~2分钟;若使用LightScanner熔解分析仪,5分钟内可以得到96孔PCR板中的全部样品的检测结果。

2.3 低成本 比普通PCR反应仅多加一种饱和荧光染料,一般情况下每个样品成本大约2元人民币。

2.4 闭管操作 PCR扩增后直接进行HRM分析,不需要对PCR产物进行处理,减少污染机会。

3 HRM的应用

HRM的分辨率高,其敏感度和特异度均优于现有的其他突变扫描方法,适用于检测单碱基突变、小片段插入或缺失。有研究显示应用质粒来验证HRM检测单个碱基杂合突变,发现当PCR产物小于400bp时,敏感度和特异度均为100%;PCR产物长度在400~1000bp时,敏感度和特异度分别为96.1%和99.4%[2]。HRM技术现被广泛应用于突变扫描、基因分型、序列匹配、物种鉴定等。

本院实验室从2009年开始应用HRM技术,目前常规用于多种单基因病的突变筛查。α-地中海贫血是我国南方人群的常见遗传病,当夫妇的一方α-基因是东南亚缺失型(SEA)时,如果另一方携带点突变型α-地中海贫血,则下一代有1/4机会生育非缺失型血红蛋白H病患儿。这种情况下需要产前诊断,因非缺失型血红蛋白H病患儿多需要输血治疗[3]。点突变型α-地中海贫血在中国人群最常见为血红蛋白Constant Spring(Hb CS)和血红蛋白Quong Sze(Hb QS),靠一般的地中海贫血筛查方法(血常规、血红蛋白分析)无法识别,确诊需要分子诊断[4]。既往使用反向点杂交技术或直接测序技术检测Hb CS和Hb QS,现已被HRM技术替代,检测敏感性和特异性均为100%[5,6]。由于这2种点突变只占人群的0.3%,先经HRM扫描,只对熔解曲线阳性者进一步采用其他分子诊断方法证实,大大减轻了DNA测序压力。

应用HRM检测的另外一种遗传病是致死性软骨发育不良I型(thanatophoric dysplasia type 1,TD 1)。TD 1多在妊娠中晚期被产前超声检查发现,表现为长骨短小、肋骨短、胸廓狭窄等,多为新生基因突变所致。但TD 1至少需要与数十种骨骼系统发育异常的疾病相鉴别,它们在超声表现上有相似之处。TD 1是由FGFR3基因突变引起,目前至少已发现11种突变类型,其中p.R248C突变最常见,经研究发现,中国人TD 1病例几乎都检测到p.R248C突变[7]。在p.R248C突变的检测上,以往应用变性梯度凝胶电泳(DGGE)、限制性内切酶分析(RFLP)和直接测序等方法进行基因诊断。但这些突变检测方法存在操作繁琐、费用高、诊断周期长等缺点。应用HRM扫描检测p.R248C突变的敏感性和特异性均为100%[8]。因此,对常规产前超声检查疑为TD 1的病例,临床上在产前取材排除染色体疾病的同时可行基因诊断,以便尽早明确诊断,协助临床处理。HRM可用于FGFR3基因p.R248C突变的快速基因检测。

此外,还将HRM技术应用于其他遗传疾病如血友病、成骨发育不全等的突变扫描。这些致病基因往往包含数十个外显子,若采用常规DNA测序来检测基因突变,工作量和成本很大。先通过HRM突变扫描,针对异常的外显子进行测序确证,将达到事半功倍的效果。

4 HRM缺点

4.1 对PCR反应、熔解仪器、荧光染料要求较高 由于双链DNA的熔解动力学受到很多因素的影响,比如DNA模板质量、镁离子含量、缓冲液组成等,所以HRM要求DNA样品由同一种方法提取,经纯化使DNA样品浓度一致。对引物及扩增片段要求高,常需反复实验,验证是否适用于HRM。熔解仪器要求非常高的温度精密度和温度均一性。荧光染料不影响PCR反应且能饱和结合双链DNA。

4.2 突变扫描不能精确区分扩增片段中的不同杂合突变 有时不同的杂合突变导致相似的熔解曲线,需进一步经混样法区分,或小片段法、非标记探针法、Snapback探针法进行基因分型提高分辨率。

4.3 PCR扩增产物的长度受到限制 随着扩增片段的增加,其敏感性及特异性降低。

5 结论

HRM是当前最好的一种高通量突变扫描和基因分型技术。如果操作得当,可以减少95%~99%的测序工作量。HRM对PCR产物无损伤性,如果HRM鉴定样本(基因分型和序列匹配)失败,可使用原样本测序进一步鉴定,对结果无影响。可以设想,随着染料和仪器的更新,这项技术还将继续迅速发展,在医学领域发挥更多的作用。

[1] Wittwer CT,Reed GH,Gundry CN,et al.High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen[J].Clin Chem,2003,49:853-860.

[2] Reed GH,Wittwer CT.Sensitivity and specificity of singlenucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis[J].Clin Chem,2004,50:1748-1754.

[3] Li DZ,Liao C.A case of transfusion-dependent nondeletional Hb H disease undiagnosed during prenatal screening for thalassemia[J].Prenatal Diagnosis,2008,28:165-166.

[4] Li DZ.Prenatal Control of Hemoglobin H Disease:is it Possible[J]?Pediatric Hematol Oncol,2011,28:86-88.

[5] Li R,Liao C,Li D,et al.High-resolution melting analysis of the three common nondeletionalα-thalassemia mutations in the Chinese population:Hbs Constant Spring,Quong Sze and Westmead[J].Hemoglobin,2010,34:587-593.

[6] Liu YN,Li R,Li J,et al.Rapid identification of hemoglobin Quong Sze mutation using high-resolution melting analysis[J].Int J Lab Hematol,2011,33(3):5-6.

[7] Yang Y,Li DZ.FGFR3gene mutations in Chinese cases of thanatophoric dysplasia type 1 [J].Fetal Diagn Ther,2009,26:90-92.

[8] Liu YN,Li R,Li DZ.Genotyping of the C742Tmutation of the FGFR3gene causing type 1thanatophoric dysplasia by high-resolution melting analysis[J].J Matern Fetal Neonatal Med,2011,24:186-188.

猜你喜欢

双链染料分型
海绵负载双组分凝胶剂对染料吸附的研究
新染料可提高电动汽车安全性
中国染料作物栽培史
昆虫共生细菌活体制造双链RNA
高职思政课“双链”教学模式的构建与实践
高职思政课“双链”教学模式的构建与实践
成人型髋关节发育不良的分型与治疗
染料、油和水
高新区科技企业孵化网络“双层双链”结构研究
基于分型线驱动的分型面设计研究