两种培养基对黄花蒿挥发油体外抑菌活性的研究

高志玲 樊 伟

（1 白城医学高等专科学校，吉林 白城 137000；2 白城市第一中学，吉林 白城 137000）

黄花蒿（Artemisia annua L.），为一年生草本植物，在全国各省份均有分布，是一种传统中草药。用于暑邪发热、阴虚发热、夜热早凉、骨蒸劳热、疟疾寒热、湿热黄疸等证[1]。黄花蒿的主要有效成分为青蒿素和挥发油等，过去的研究主要集中在青蒿素上[2]，对挥发油的研究很少。本实验采用了普通营养培养基和抗生素实验用的M-H培养基初步研究了黄花蒿挥发油的体外抑菌活性，以期为黄花蒿的综合利用和天然食品防腐剂的开发提供参考，同时探讨两种不同培养基对中药抑菌活性的检测效果。

1 试验材料

1.1 样品来源

野生黄花蒿采自吉林省白城市近郊，经东北师范大学生命科学学院肖洪兴教授鉴定为菊科植物（Artemisia annua L.）。

1.2 菌种来源

枯草杆菌（Bacillus subtilis）、四联球菌（Micrococcus tetragenus）、变形杆菌（proteusbacillus vulgaris）、粪链球菌（Fecal streptococcus）均由白城医学高等专科学校微生物实验室提供。

1.3 仪器

BB89-2000挥发油提取器：北京中西泰安技术服务有限公司；AY220电子天平：日本岛津公司；78-1型电热恒温培养箱：湖北省黄石市医疗器械厂；MLS3750型高压蒸汽灭菌器：SANYO；YJ-875型医用超净工作台：苏净集团安泰公司。

2 方 法

2.1 黄花蒿挥发油的制备

取黄花蒿全草的鲜品，水蒸气蒸馏法提取得到淡黄色油脂，即为黄花蒿挥发油。黄花蒿挥发油用吐温80乳化，再溶解于一定体积的水中，配制成3.125～50.0mg/mL不同浓度的溶液，于冰箱中4℃保存备用。

2.2 培养基制备

①营养琼脂培养基制备:称取营养琼脂22.5g加500mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，121℃高压灭菌20min备用。②M-H琼脂培养基制备:称取16.5gM-H琼脂加500mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，121℃高压灭菌20min备用。

2.3 纸片法测定抑菌效果

用打孔器将干净的滤纸制成直径为0.5cm的小圆纸片，干热灭菌后，分别浸入不同浓度的溶液中，使其充分吸收，备用。在超净台里用无菌的1mL移液管吸取菌悬液1滴置于倒好培养基的培养皿中央，涂布均匀。将浸泡处理过的滤纸片沥干，贴在上述含菌平板上，每个平板贴3片相同黄花蒿挥发油浓度的滤纸片。吐温80和无菌水的混合液作为空白对照，重复实验2次。置于培养箱中37℃培养18h，测量抑菌圈的直径。每个培养皿上的实验结果取平均值。

2.4 试管法测定最低抑菌浓度（MIC）

根据滤纸片法所得的结果，参照文献[3]，采用试管法对各受试菌种进行最低抑菌浓度测定（MIC）。两种培养基分别以每管总体积5mL分装于试管中，121℃，0.1Mpa条件下灭菌20min。当灭菌培养基冷却至50℃左右时，加入黄花蒿挥发油，倍比稀释成0.3125～20.0mg/mL梯度浓度，充分混匀，无菌水做对照，分别制成斜面。取生长良好的受试菌划线接种于斜面上。置于37℃温箱中培养，观察24h菌落生长状态。取完全不生长管最低样品浓度为最低抑菌浓度（MIC）。

3 结果与分析

3.1 不同质量浓度黄花蒿挥发油抑菌效果

用吐温80和无菌水配制50.0mg/mL、25.0mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.125mg/mL的挥发油溶液，采用滤纸片扩散法测定黄花蒿挥发油在两种培养基上的抑菌活性。实验结果显示黄花蒿挥发油对试验菌均有明显的抑制作用，随着质量浓度的增大，抑菌效果均呈上升趋势。在50.0mg/mL时，四联球菌、粪链球菌、枯草杆菌、变形杆菌在普通培养基上的抑菌圈直径分别是9.8mm、10.6mm、9.2mm、7.2mm，在M-H培养基上的抑菌圈直径分别是10.5mm、11.3mm、10.8mm、8.5mm，黄花蒿挥发油对革兰阳性菌（四联球菌、粪链球菌和枯草杆菌）的生长有明显的抑菌作用，对革兰阴性菌（变形杆菌）的生长抑制作用相对较弱，其抑菌机制有待于进一步研究。

3.2 最低抑菌浓度（MIC）的测定

用培养基配制20.0mg/mL、10.0mg/mL、5.0mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL的黄花蒿挥发油溶液，采用试管法测定样品MIC，取完全不生长管最低样品浓度作为最低抑菌浓度，结果显示四联球菌、粪链球菌和枯草杆菌在普通培养基上的MIC均为5mg/mL，在M-H培养基上的MIC均为2.5mg/mL，而变形杆菌在普通培养基上的MIC为10mg/mL，在M-H培养基上的MIC为5mg/mL，此实验结果与滤纸片法结果相一致。

在相同试验条件下，根据抑菌圈直径大小和最低抑菌浓度可以判断M-H琼脂培养基对黄花蒿挥发油抑菌作用的检测灵敏度高。中药抗菌试验一直用普通培养基，通过本试验研究结果，建议今后在中药抗菌试验中采用M-H琼脂培养基。

[1] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:人民卫生出版社,1985:166.

[2] 李伟,石崇荣.青蒿素研究进展[J].中国药房,2003,14(2):118.

[3] 弭向辉,龚祝南,张卫明,等.花椒挥发油的提取、分离和抗菌实验[J].南京师大学报,2004,27(4):63-66.