MicroRNA与膀胱癌的研究进展

蒋海锋 综述 薄隽杰 审校

上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿外科，上海 200127

膀胱癌是一个重要的公共问题，在世界范围内，膀胱癌的发病率居恶性肿瘤的第九位，是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其中90%以上为膀胱移行细胞癌(bladder transitional cell carcinoma，BTCC)［1-2］。膀胱镜检查及尿脱落细胞学检测仍是当前诊断膀胱癌不可替代的金标准，由于膀胱镜检查会带给患者创伤和昂贵的检测费用，而细胞学检查的敏感性低。因此，膀胱癌的分子生物学研究日益受到国内外学者的重视，希望从分子水平上揭示膀胱癌的发生、发展、转移及转归，从而提高膀胱癌的诊治水平。近年来的研究表明，多种微小RNA(MicroRNA，miRNA)参与了肿瘤细胞的生物调控过程，间接地起着原癌基因和抑癌基因的功能，在肿瘤的发生和发展中起了至关重要的作用［3］。

1 miRNA介绍

miRNA是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由19～25个核苷酸(nucleotide，nt)组成，平均为22个nt［4］。这些小的miRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过与靶mRNA特异的碱基配对引起靶mRNA的降解或翻译抑制，在转录后水平调控基因表达，从而起着调控细胞分化、生长、增殖、代谢和凋亡等功能［5］。

1.1 miRNA的合成

首先，miRNA基因产生的初级产物(primiRNA)在核内被RNA酶Ⅲ Drosha-DGCR 8(Disgorge syndrome critical region8)复合体所切割，形成约由60～70个核苷酸组成的、具有发夹结构的miRNA前体(precursor microRNA，premiRNA)。然后，迅速被Ran-GTP依赖的转运蛋白Exportin-5转运至细胞质。最后，在细胞质内经Dicer酶切割形成约22 nt的双链RNA片段，随后被整合至RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中形成RISC-miRNA复合体，其中一条链降解，另一条生成成熟的miRNA保留在复合体中。RISC-miRNA复合体与靶mRNA完全或不完全匹配，调控靶mRNA降解或阻遏其转录后翻译，影响蛋白质的合成，从而调节细胞增殖、分化与凋亡，参与个体发育、机体代谢以及肿瘤发生、发展等过程［6-7］。

1.2 miRNA的功能

人体内大约含有1 000种miRNA，但却调控着大约30%的mRNA翻译。正常组织中，miRNA正常转录、加工，与mRNA特异结合，通过抑制翻译或使mRNA降解而调节基因的表达。如果miRNA与其相应的靶mRNA以完全互补的方式结合在开放阅读框，mRNA将发生特异性降解；如果miRNA以部分互补的方式结合在mRNA的3’端非翻译区(3’UTR)，则仅仅抑制其翻译，不影响mRNA的稳定性。miRNA的5’端有2～8个核苷酸区被称为“种子区”，对miRNA与mRNA的3’UTR的配对非常重要［8］。miRNA“种子区”通常和相应的靶序列完全配对，因此可以用“种子区”序列预测miRNA的靶基因。在大多数情况下，miRNA“种子区”和相应靶序列的完全配对是其起调控作用的前提条件。一种miRNA可作用于多种mRNA靶点［9］，多个miRNA也可以作用于一个mRNA［10］。mRNA 的3’UTR可以包含多个miRNA的作用位点，并且与抑制翻译的程度有关，miRNA结合的位点越多，抑制的程度就越大。由此形成复杂而又精确的网络，调控着生物体的基因表达及生理功能，一旦miRNA的表达水平失衡，将可能导致疾病的发生。

2 miRNA与肿瘤的关系

肿瘤的发生是由于肿瘤细胞的无限增殖或凋亡失控引起的。正常的细胞已形成保护功能，以确保细胞的分裂、分化和凋亡过程协调有序地进行。虽然很多研究表明miRNA在肿瘤中表达异常，但对于它们的具体机制并未完全明了。目前大部分研究认为miRNA与肿瘤的发生有关是基于以下几点：⑴在不同的肿瘤中，某些miRNA特异性的表达增多，显示这些miRNA与基因突变一样，可能为肿瘤的发生提供了某些有利因素［11-12］；⑵研究发现，miRNA直接调控肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡［13］；⑶许多miRNA直接表现为一种原癌基因或抑癌基因的作用［14-15］。因此，miRNA是一种新的生物分子，与肿瘤的发生、发展、转移和预后存在着密切的联系。

2.1 原癌基因作用

miRNA-155位于BIC基因第三个外显子内，BIC基因是已知的癌基因之一。在人类B细胞淋巴瘤中，人们发现miRNA-155/BIC表达水平普遍增高，导致细胞异常增殖。还有研究发现，miRNA-155能直接下调myc基因的抑制因子(如MAD1、MXI1、ROX/MNT等)的表达，从而增强myc基因的活性，导致细胞发生癌变，形成B细胞淋巴瘤［16-17］。因此，miRNA-155可能作为一个原癌基因与myc基因具有协同作用。miRNA-10b位于HOXD基因家族，其表达水平在乳腺癌中明显上调，其转录过程受转录因子Twist调控，该系列通过调控HOXD基因而提高转移相关基因RHOC表达水平，促进肿瘤的增殖和转移［18］。一项利用芯片的独立研究检测245个miRNA在正常组织和肿瘤组织中的表达差异，发现胶质母细胞瘤中miRNA-21表达升高，而在乳腺癌样品中表达也有增加，因此认为miRNA-21可能在肿瘤发生中起到广泛的作用［19］。也有应用反义核酸技术的研究发现，其通过抑制凋亡而并非促进细胞增殖来导致细胞的癌变［20-21］。另有研究发现，miRNA的异常可能会导致具有肿瘤特异性表型的表观遗传基因程序重组细胞的出现，而这些细胞日后将引起癌变［22］。

2.2 抑癌基因作用

某些miRNA表达的下调可能会引起肿瘤细胞侵袭力的增加，导致患者预后不佳，生存率下降。Takamizawa等［23］在2004年报道了第一个与肺癌相关的miRNA-let-7(let-7)，发现在非小细胞肺癌患者中let-7表达显著降低。Johnson等［24］的研究发现，let-7高表达的肺癌患者生存率要显著高于低表达患者，这可能是由于let-7过表达可负调控靶基因Ras的表达，抑制肺癌生长。Iorio等［19］对76例乳腺癌患者的肿瘤细胞进行miRNA表达分析发现，在乳腺癌患者中随着miRNA-145的下调，肿瘤的增殖指数升高，miRNA-9-3在有高度血管侵袭和淋巴结转移的乳腺癌患者中表达下调，提示miRNA-145和miRNA-9-3的正常表达可能有抑制肿瘤的作用。另一项关于乳腺癌和miRNA的研究发现，当乳腺癌具有转移能力时，一些miRNAs的表达显著缺失，而恢复这些miRNAs的表达则可抑制肿瘤细胞向肺部和骨骼的转移［25］。miRNA-203在结直肠癌组织和细胞株中表达显著降低，并可以抑制肿瘤细胞株的增殖，而且miRNA-203低表达的患者肿瘤数目更多和病理分期更高［26］。还有研究还发现，在慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)中， miRNA-15a和miRNA-16-1的表达下调将导致抗凋亡基因Bcl-2的明显上调，并抑制肿瘤细胞的凋亡［27］，同时也可通过靶基因(cyclin D，CDK6)参与细胞周期的调控，抑制肿瘤细胞的增殖［28］，这些现象均提示某些miRNA具有抑癌基因的作用。

3 miRNA与膀胱癌的关系

目前，关于miRNA与膀胱癌的研究已经展开，并在不断深入。几个基于芯片技术和生物信息学的研究已发现一些与膀胱癌密切有关的miRNA。但这些miRNA到底是通过哪些具体的机制来促进或抑制膀胱癌的发生，目前还不是很清楚。

2009年有研究发现，miRNA的表达与膀胱癌的分期有关，在浅表性膀胱癌中高表达的有miRNA-10a，在肌层浸润性膀胱癌中高表达的有miRNA-222和miRNA-125b，而在淋巴结阳性患者中高表达的有miRNA-452，认为miRNA-452能成为一种预测膀胱癌患者预后的指标［29］。最近Wiklund等［30］的研究发现，miRNA-200家族和miRNA-205在浅表性膀胱癌中表达要比在肌层浸润性膀胱癌中高1.5～2.5倍，而且在浸润性膀胱癌中miRNA-200家族和miRNA-205经常发生表达沉默，提示它们可能与肿瘤的进展有关，进一步研究发现miRNA-200c的表达与早期(Ta、T1期)膀胱癌的进展有关，能成为一种预测早期膀胱癌进展的生物学指标，并且可以指导早期膀胱癌治疗方案的选择。

Catto等［31］检测了322个miRNA，发现有12个miRNA仅在膀胱癌组织中表达，其中有5～7个具有较高的诊断价值，灵敏度为90%～100%，特异度为80%～100%，miRNA-99a/100的表达下调可能预示着一个更好的结局，而miRNA-21/373表达升高的患者可能预后更差。Neely等［32］分析了膀胱癌细胞株中343个miRNA的表达水平，发现其中有9个miRNA(miR-21/miR-31/miR-200a/miR-200c/miR-205/miR-373/miR-487b/miR-498/miR-503)在浅表性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌中表达不同。进一步研究发现，相对于浅表性膀胱癌，浸润性膀胱癌中miR-21表达升高，而miR-205表达下降，并且，在浸润性膀胱癌中，miR-21：miR-205的比值要比浅表性膀胱癌高至少10倍以上，此比值能有效地区分浅表性和浸润性膀胱癌，其灵敏度达100%，特异度为78%，能成为评价膀胱肿瘤浸润性的潜在指标。

Chiyomaru等［33］通过寡核苷酸芯片技术分析显示，转染了miRNA-145/miRNA-133a的膀胱癌细胞株，大约有200个基因发生表达减少，而FSCN1(束蛋白1)基因是下调最明显的。通过荧光素酶基因分析表明，膀胱癌细胞株转染了miRNA-145/miRNA-133a后，FSCN1蛋白表达明显减少，细胞的增殖、侵袭以及转移显著性受到抑制(P＜0.0001)。Dyrskjøt等［34］认为转染了miRNA-129的膀胱癌细胞株，其细胞的生长明显变的缓慢，进一步研究发现miRNA-129可能参与了细胞的凋亡过程，引起肿瘤细胞的自发凋亡。Ichimi等［35］发现，转染了miRNA-30a-3p/miRNA133a/miRNA-199a的膀胱癌细胞株，其KRT7(角蛋白)的表达减少，进而抑制肿瘤细胞的生长。而Huang等［36］发现，miRNA-125b通过减少细胞周期中转录因子E2F3蛋白的表达，抑制E2F3-cyclinA2信号途径，使膀胱肿瘤细胞生长在G期发生停滞。另一项研究发现miRNA-221在膀胱癌细胞中表达升高，如果使miRNA-221发生表达沉默，能通过TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)途径促使肿瘤细胞发生凋亡［37］。我们之前首次证实在膀胱癌组织中miRNA-203表达减低，而且在膀胱癌细胞株中，我们发现miRNA-203的高表达将抑制细胞的增殖，通过进一步研究，我们发现miRNA-203可能通过抑制Bcl-w基因的表达来发挥其抑癌基因的作用［38］。基因突变是公认的与肿瘤发生最相关的机制，van der Kwast等［39］认为在膀胱癌发生过程中，miRNA-7的表达下调和miRNA-10a的表达上调与FGFR3基因的突变机制有关，认为这些miRNA能成为优先于临床和病理而早期诊断膀胱肿瘤的指标。

一直以来，所有泌尿科医生都希望能利用尿液来早期发现膀胱肿瘤，但理想的尿液膀胱肿瘤标志物仍未被发现。目前，关于尿液中miRNA的研究也已开展。一项来自德国的研究发现，通过检测尿液中miRNA-126：miRNA-152以及miRNA-182：miRNA-152的比值能将膀胱癌患者从正常人之中筛选出来，其中miRNA-126：miRNA-152的比值敏感度达72%，特异度达82%［40］。

4 展望

随着对miRNA在膀胱癌中研究的深入，发现越来越多的miRNA与膀胱癌密切相关。miRNA通过表达上调或下调，与某些原癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因相互作用，或调解某些细胞因子，参与肿瘤的生成、发展甚至侵袭转移。但目前关于miRNA与膀胱癌的研究尚处于起步阶段，如何精确预测miRNA及其靶mRNA，miRNA抑制靶基因蛋白翻译的具体作用机制，以及哪些细胞因子参与了这些过程等等，都是等待我们去探索的未知区域。随着最新的生物学实验技术应用于miRNA的研究，人们对miRNA的表达调控网络的认识将提高到一个新的水平。相信在不久的将来，以miRNA为靶点的诊断措施及生物靶向治疗会应用于临床中，为膀胱癌的治疗提供一个更有效的手段。

［1］Jemal A, Siegel R, Xu J, et al.Cancer statistics, 2010［J］.CA Cancer J Clin, 2010, 60(5): 277-300.

［2］杨国良, 薄隽杰.尿液中膀胱肿瘤标志物检测的研究进展［J］.中国癌症杂志, 2009, 19(7): 557-561.

［3］Zhang B, Pan X, Cobb GP, et al.MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors［J］.Dev Biol, 2007, 302(1): 1-12.

［4］Bartel DP.MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism,and function［J］.Cell, 2004, 116(2): 281-297.

［5］Thomson JM, Newman M, Parker JS, et al.Extensive posttranscriptional regulation of microRNAs and its implications for cancer［J］.Genes Dev, 2006, 20(16): 2202-2207.

［6］Liu J, Carmell MA, Rivas FV, et al.Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi［J］.Science, 2004, 305(5689):1437-1441.

［7］Gregory RI, Shiekhattar R.MicroRNA biogenesis and cancer［J］.Cancer Res, 2005, 65(9): 3509-3512.

［8］Beezhold KJ, Castranova V, Chen F.Microprocessor of microRNAs: regulation and potential for therapeutic intervention［J］.Mol Cancer, 2010, 9: 134.

［9］Abrahante JE, Daul AL, Li M, et al.The caenorhabditis elegans hunchback-like gene lin-57/hbl--1 controls developmental time and is regulated by microRNAs［J］.Dev Cell, 2003, 4(5): 625-637.

［10］Ambros V.The functions of animal microRNAs［J］.Nature,2004, 431(7006): 350-355.

［11］Volinia S, Calin GA, Liu CG, et al.A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets［J］.Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(7): 2257-2261.

［12］Lanza G, Ferracin M, Gafà R, et al.mRNA/microRNA gene expression profile in microsatellite unstable colorectal cancer［J］.Mol Cancer, 2007, 6: 54.

［13］Gaur A, Jewell DA, Liang Y, et al.Characterization of microRNA expression levels and their biological correlates in human cancer cell lines［J］.Cancer Res, 2007, 67(6):2456-2468.

［14］Slaby O, Svoboda M, Michalek J, et al.MicroRNAs in colorectal cancer: translation of molecular biology into clinical application［J］.Mol Cancer, 2009; 8: 102.

［15］Sayed D, Rane S, Lypowy J, et al.MicroRNA-21 targets Sprouty2 and promotes cellular outgrowths［J］.Mol Biol Cell, 2008, 19(8): 3272-3282.

［16］Metzler M, Wilda M, Busch K, et al.High expression of precursor microRNA-155/BIC RNA in children with Burkitt lymphoma［J］.Genes Chromosomes Cancer, 2004, 39(2):167-169.

［17］Eis PS, Tam W, Sun L, et al.Accumulation of miR-155 and BIC RNA in human B cell lymphomas［J］.Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(10): 3627-3632.

［18］Ma L, Teruya-Feldstein J, Weinberg RA.Tumour invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer［J］.Nature, 2007, 449(7163): 682-688.

［19］Iorio MV, Ferracin M, Liu CG, et al.MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer［J］.Cancer Res, 2005, 65(16): 7065-7070.

［20］Ciafrè SA, Galardi S, Mangiola A, et al.Extensive modulation of a set of microRNAs in primary glioblastoma［J］.Biochem Biophys Res Commun, 2005, 334(4): 1351-1358.

［21］Chan JA, Krichevsky AM, Kosik KS.MicroRNA-2l is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells［J］.Cancer Res, 2005, 65(14): 6029-6033.

［22］Kovalchuk O, Tryndyak VP, Montgomery B, et al.Estrogeninduced rat breast carcinogenesis is characterized by alterations in DNA methylation, histone modifications and aberrant micioRNA expression［J］.Cell Cycle, 2007, 6(16):2010-2018.

［23］Takamizawa J, Konishi H, Yanagisawa K, et al.Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancer in association with shortened postoperative survival［J］.Cancer Res, 2004, 64(11): 3753-3756.

［24］Johnson SM, Grosshans H, Shingara J, et al.RAS is regulated by the let-7 microRNA family［J］.Cell, 2005, 120(5): 635-647.

［25］Tavazoie SF, Alarcón C, Oskarsson T, et al.Endogenous human microRNAs that suppress breast cancer metastasis［J］.Nature, 2008, 45l(7175): 147-152.

［26］Chiang Y, Song Y, Wang Z, et al.Aberrant expression of miR-203 and its clinical significance in gastric and colorectal cancers［J］.J Gastrointest Surg, 2011, 15(1): 63-70.

［27］Cimmino A, Calin GA, Fabbri M, et al.microR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2［J］.Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(39): 13944-13949.

［28］Linsley PS, Schelter J, Burchard J, et al.Transcripts targeted by the microRNA-16 family cooperatively regulate cell cycle progression［J］.MoI Cell Biol, 2007, 27(6): 2240-2252.

［29］Veerla S, Lindgren D, Kvist A, et al.MiRNA expression in urothelial carcinomas: important roles of miR-10a, miR-222, miR-125b, miR-7 and miR-452 for tumor stage and metastasis, and frequent homozygous losses of miR-31［J］.Int J Cancer, 2009, 124(9): 2236-2242.

［30］Wiklund ED, Bramsen JB, Hulf T, et al.Coordinated epigenetic repression of the miR-200 family and miR-205 in invasive bladder cancer［J］.Int J Cancer, 2011, 128(6):1327-1334.

［31］Catto JW, Miah S, Owen HC, et al.Distinct microRNA alterations characterize high- and low-grade bladder cancer［J］.Cancer Res, 2009, 69(21): 8472-8481.

［32］Neely LA, Rieger-Christ KM, Neto BS, et al.A microRNA expression ratio defining the invasive phenotype in bladder tumors［J］.Urol Oncol, 2010, 28(1): 39-48.

［33］Chiyomaru T, Enokida H, Tatarano S, et al.miR-145 and miR-133a function as tumour suppressors and directly regulate FSCN1 expression in bladder cancer［J］.Br J Cancer, 2010, 102(5): 883-891.

［34］Dyrskjøt L, Ostenfeld MS, Bramsen JB, et al.Genomic profiling of microRNAs in bladder cancer: miR-129 is associated with poor outcome and promotes cell death in vitro［J］.Cancer Res, 2009, 69(11): 4851-4860.

［35］Ichimi T, Enokida H, Okuno Y, et al.Identification of novel microRNA targets based on microRNA signatures in bladder cancer［J］.Int J Cancer, 2009, 125(2): 345-352.

［36］Huang L, Luo J, Cai Q, et al.MicroRNA-125b suppresses the development of bladder cancer by targeting E2F3［J］.Int J Cancer, 2011, 128(8): 1758-1769.

［37］Lu Q, Lu C, Zhou GP, et al.MicroRNA-221 silencing predisposed human bladder cancer cells to undergo apoptosis induced by TRAIL［J］.Urol Oncol, 2010, 28(6): 635-641.

［38］Bo J, Yang G, Huo K, et al.microRNA-203 suppresses bladder cancer development by repressing bcl-w expression［J］.FEBS J, 2011, 278(5): 786-792.

［39］van der Kwast TH, Bapat B.Predicting favourable prognosis of urothelial carcinoma: gene expression and genome profiling［J］.Curr Opin Urol, 2009, 19(5): 516-521.

［40］Hanke M, Hoefig K, Merz H, et al.A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker: microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancer［J］.Urol Oncol, 2010, 28(6): 655-661.