前列腺癌雄激素依赖转化后雄激素受体基因表达变化的研究

潘寿华 阎家峻 郑专

绍兴市人民医院泌尿外科，浙江 绍兴 312000

雄激素阻断是晚期前列腺癌首选治疗方法，但一般经12～18个月的治疗后会转变为雄激素非依赖性前列腺癌，患者最终往往死于雄激素不敏感癌细胞的广泛转移［1］。前列腺癌这种雄激素依赖性转化的机制目前尚不完全清楚，本研究主要从AR基因表达水平变化方面来探讨前列腺癌雄激素依赖转化的可能机制，为雄激素非依赖性前列腺癌的临床治疗提供理论基础。

1 资料和方法

1.1 临床资料

所有病例均为在本院治疗的晚期前列腺癌患者，共33例，均符合以下条件：⑴治疗前均经病理和影像学检查确诊为C或D期的前列腺癌患者。⑵均接受正规抗雄激素治疗，方法包括双侧睾丸切除或皮下注射醋酸亮丙瑞林(商品名抑那通，日本武田制药公司生产)、口服比卡鲁胺(商品名康士得，英国阿斯利康公司生产)。⑶随访期间根据需要能前后2次获取前列腺癌组织标本。根据是否发生雄激素依赖转化的标准［2］分为雄激素依赖转化组和雄激素依赖无转化组。雄激素依赖转化组：18例，年龄59～82岁，平均年龄69岁。内分泌治疗时间为13～36个月，发生雄激素依赖转化时间为12～24个月。雄激素依赖无转化组：15例，年龄60～81岁，平均年龄70岁。内分泌治疗时间为12～35个月。

1.2 RT-PCR法测定前列腺癌中AR基因表达

提取细胞总RNA，RT-PCR反应步骤：0.5 mL离心管中加入4 μg总RNA，Oligo(dT)18 μL，加DEPC处理水至12 μL，70 ℃温育5 min后取出冰浴，依次加入5×反应缓冲液4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，RNA酶抑制剂1 μL(20 U)，37 ℃温浴5 min后，加1 μL(200 U)M-MuLV逆转录酶，混匀后42 ℃ 温浴1 h，70 ℃灭活10 min。PCR反应体系为2×反应缓冲液12.5 μL、引物正反义链各0.5 μL、模板DNA 2 μL以及DEPC处理水9.5 μL至终体积25 μL。AR的反应参数:93 ℃预变性3 min，93 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s；29个循环， 72 ℃终延伸10 min。β-actin的反应参数:94 ℃预变性3 min， 94 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s；29个循环，72 ℃终延伸5 min。AR引物正义链：5’-GCAATCATTTCTGCTGGCGCA-3’，反义链：5’-AGCTACTCCGGACCTTACG-3’。β-actin正义链：5’-GTGGGGCGCCCCAG GCACCA-3’，反义链：5’-CTTCCTTAATG TCACGCACGATTTC-3’，引物由上海生物工程公司合成。

1.3 统计学处理

两组数据均数比较采用t检验，数据以平均数±标准差()表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

33例前列腺癌患者在研究期间有18例患者发生了雄激素依赖转化，发生时间为(18±5)个月，15例患者未发生雄激素依赖转化。采用RT-PCR法检测AR基因在雄激素依赖转化组及无转化组前列腺癌细胞内表达情况，雄激素依赖转化组转化后AR基因表达水平明显高于转化前［(36.7±1.8) Ctvs(28.4±3.4) Ct，t=14.43，P＜0.001］，而雄激素依赖无转化组AR基因表达水平无明显变化［(29.1±3.2) Ctvs(29.5±3.1) Ct，t=0.409，P＞0.05］。

3 讨 论

前列腺癌雄激素依赖发生转化的分子生物学机制仍不十分明了，但目前比较一致的看法是AR在这一过程中有着重要的作用［3］。过去人们曾通过研究前列腺癌的体外模型发现前列腺癌雄激素依赖发生转化后常伴有AR蛋白表达下调或缺失，认为晚期前列腺癌经内分泌治疗一段时间后表达AR的肿瘤细胞发生凋亡，而缺乏AR表达的肿瘤细胞选择性的过度克隆增殖是导致前列腺癌雄激素依赖发生转化的重要原因［4］。Chodak等［5］用半定量方法检测AR在前列腺癌中的表达发现，AR的表达量与前列腺癌分化程度呈负相关，Greenberg等［6］在前列腺癌转基因鼠动物模型中亦观察到相似的结果。国内张秉鸿等［7］使用免疫组化及图像分析技术检测前列腺癌中AR的含量也发现，随着前列腺癌恶性程度增加，AR表达减少，发生雄激素依赖转化后AR表达较转化前明显下降，而AR表达与前列腺癌的临床分期无明显相关性。

随着分子生物学技术及AR基因检测技术的不断进展，近年来许多研究却发现了与过去截然不同的结果。Linja等［8］使用实时RT-PCR法检测一组前列腺癌标本发现，雄激素依赖转化的病例AR转录水平较抗雄激素治疗有效的病例高6倍，Brown等［9］应用FISH法检查18例雄激素依赖转化前列腺癌中的AR基因和9例原发肿瘤AR基因情况，发现9/18的雄激素依赖转化前列腺癌有AR基因的扩增，而未治疗的原发前列腺癌中无AR基因的扩增，Chen等［10］证实雄激素依赖转化的前列腺癌中AR cDNA、mRNA、蛋白的表达均高于雄激素依赖前列腺癌，Koivisto等［11］使用比较基因组杂交技术发现有30%雄激素依赖转化前列腺癌有AR基因扩增，国内张勇等［12］采用RBA法研究证实，雄激素依赖转化前列腺癌患者的AR表达量高于雄激素依赖患者的AR表达量，甘道举等［13］用免疫组化两步法检测15例中国人雄激素依赖抵抗性前列腺癌AR表达发现，仅1例AR表达阴性，其余表达均为强阳性，AR染色的平均光密度值较雄激素依赖性前列腺癌明显升高，表明雄激素依赖转化前列腺癌有更高的AR基因扩增率。我们通过33例病理确诊并能接受正规抗雄激素治疗的晚期前列腺癌患者进行较长时间随访，在相同随访时间内共有18例患者出现雄激素依赖转化，15例患者雄激素依赖无转化。我们对前列腺癌患者在雄激素依赖转化前后的前列腺癌组织标本行实时RT-PCR方法测定细胞内AR基因的表达，与同时期内雄激素依赖无转化的前列腺癌患者标本作为对照。在雄激素治疗前后标本利用实时RT-PCR方法测定细胞内AR基因的表达，也有同样的发现，雄激素依赖转化组转化后AR基因表达水平明显高于转化前[(36.7±1.8)ctvs(28.4±3.4)ct，P＜0.001]，而雄激素依赖无转化组AR基因表达水平无明显变化[(29.1±3.2)ctvs(29.5±3.1)ct，P＞0.05]。我们认为经过内分泌治疗后前列腺癌细胞适应了低水平的雄激素环境，AR转录水平升高，使AR对低浓度雄激素的敏感性增强，前列腺癌细胞失去对生长的调控，在极低浓度雄激素环境下仍能无限增殖，这可能是前列腺癌产生雄激素依赖转化的重要机制之一。

AR因存在着组织学标本的体内生物学差异，或体内与体外细胞中的生物学差异，或非亲本细胞株之间的基因差异等因素影响，对于前列腺癌生物学特性转变机制的研究，由于缺乏准确模拟其临床特点的细胞和动物模型，从而限制了相关研究的进展［14］。

本研究发现前列腺癌发生雄激素转化后细胞内AR基因表达明显增加，提示前列腺癌发生雄激素转化机制与AR基因扩增有关。AR作为雄激素非依赖前列腺癌治疗的靶点，是以后临床治疗及药物研制的方向。

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