中药血清药理方法学的研究概况

2011-02-11朱建华

中国医药指南 2011年6期

柯玮朱建华

（皖南医学院医学三系，安徽芜湖 241002）

由于中药粗制剂中含有大量杂质，另外，中药作用人体后发挥作用的具体成分不详，若直接加入体外反应系统，其pH、鞣质、无机盐等许多非特异性理化因素，都会干扰实验，产生假阳性或假阴性结果；另外，中药口服后其有机成分在胃肠内会受到消化液和肠道菌微生态转化，特别是苷类化合物，其糖基使之不易从肠道吸收，肠道菌使苷分解，释放的苷元易被肠道吸收而成为真正产生药效的物质。所以中药直接用于体外实验因其科学性较差，难以得到认可。而血清药理学的实验方法克服了这些问题。血清药理学是指将中药、中药复方以及不明成分的药物给动物灌服一定时间后，采集动物血清，用此含药成分的血清作为药物源加入离体反应系统中研究其药理作用的实验方法[1]。血清药理学是日本学者Hiroko Iwama在1984年第一届和汉医学会上首次提出的，近年来，我国越来越多的中药专家应用此法来研究中药药理作用。从而避免了中药体外用药的干扰，直接反映中药及其代谢产物的药理作用。本文就关于血清药理实验的报道加以综述。

1 实验动物的选择

常用实验动物为小鼠、大鼠，也可用兔、豚鼠等。不同种属的动物血清成分不同，所以应尽量选用与人类生物学特性近似的物种[2]，从而缩小动物血清和人类血清在生理、生化等状态下的差异，减少因种属差异而造成的免疫反应，提高实验结果的可靠性[3]。在进行体外培养实验时尽量采用同种血清，可以避免了多种血清的干扰[4]。由于动物在生理状态下与病理状态下对药物消化吸收不同，对药物生物转化不同，药物的作用下机体反应不同，即正常动物采集的血清和病理状态动物采集的血清的作用可能存在差异。有学者用两种方法制备的清肝化瘀方药含药血清对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响表明，发现病理状态下和正常情况下大鼠制备的含药血清对肝癌细胞的抑制作用不一样，病理大鼠的含药血清还能促进肝癌细胞凋亡。因此，需要根据各实验要求选用不同的实验动物和不同状态下的实验动物[5]。

2 给药剂量

含药血清加入到体外的实验后，浓度会被稀释，导致可能出现假阳性或者阴性的结果，当然，也并不能排除是否系由于药物浓度过低造成的。给药剂量=临床常用量×动物等效剂量系数×培养基内的稀释度。这一方法的可以部分的弥补含药血清在体外反应系统中的被稀释。缺点是血药浓度并不能与给药剂量呈等倍数增加，对药味多、剂量大的复方在给动物灌服时可能有困难，达不到公式所要求的量；将含药血清制成冻干粉，给实验动物灌服，使之能够在动物血中达到需要的浓度。这一方法可以根据实验的需要，相应的提高实验动物血中的含药浓度，并且有利于血清的贮藏保存。体内给药并不是剂量越大所得血清药理效应越好[6]，而是要考虑到临床实际确定给药剂量，随意增加给药剂量是非常危险的[7]。也有些人认为究竟采取什么剂量，最好是通过预试验解决[8]。

3 给药方案

在进行中药血清药理实验之前必须确定合适的给药方案[9]，是否禁食、给药的次数以及给药间隔都将会对血药浓度产生影响。

食物可以改变胃肠道理化性质，影响其功能状态，减慢药物在体内的吸收过程，使血药浓度达到实验的要求的时间难以确定，甚至达不到实验要求。因此在进行血清药理实验之前必须考虑是否禁食以及禁食时间的长短。一般情况下，应在动物实验前禁食8～12h，保持空腹状态下进行实验，避免其他因素带来的干扰。崔晓兰等发现3次给药法，给家兔灌服桂枝汤，单次给药后1、2、3h所采集的含药血清无抑制副流感病毒致细胞病变的作用，但每日给药1次，连续3d，末次给药2h后的血清，有明显抑制副流感病毒致细胞病变的作用。还有人提出每日1次连续7～10d给药，每隔一个半衰期给药一次，连续4～6次。采用中药血清药理学方法开展研究，有必要先确定受试制剂的给药方案，这样所取含药血清才能较好反映药物所具有作用[10]。这些方法的目的都是使血药浓度达到稳定再采血，从而便于药物机制的研究。

4 采血时间

如果能在给药的峰浓度时间段内采血效果最好，能够避免由于有效物质尚未吸收或代谢殆尽而造成的假阴性结果。但是不同的药物甚至同一药物的不同有效成分，它们达到峰浓度的时间都不尽相同[11]。因此，采血很难有统一的标准。有研究者认为多数药物的达峰时间在药后1～2h，采血时间定为给药后2h。也可在末次连续给药后2次，间隔1h，第2次药后1h采血。李仪奎则认为每日给药2次，连续3d，末次给药1h后采血。部分学者以含药物血清抗血小板释放5-HT和阻滞内皮细胞钙通道作用为指标，探讨影响中药血清药理学方法开展的重要因素——制备含药物血清的采血时间，并进行了时效关系的研究。结果显示：给药后30min采血所得血清作用最佳。达到近似稳态血药浓度时采血制备的含药血清用来检验的效果最好[12]；最可靠的方法是先通过对少量动物进行预实验，根据不同的实验要求，将不同时间的采集的含药血清进行实验比较，再确定采血时间；梅彦芳[13]建议：含中药或复方的血清制备，采血时间的确定还须考虑复方的剂型以及机体功能的状态，并结合其药效动力学参数来确定。

5 含药血清的处理与保存

一般处理血清的方法有丙酮法、乙醇法、放置56℃水浴中、灭活30min。其中，水浴灭活最常用。血清中原来的蛋白质、生物碱等生物活性物质，它们会对体外培养的细胞产生影响，血清灭活后可减少干扰因素对实验的影响[14]。推荐进行体外抗病毒实验时宜采用灭活血清较好[15]，以含桂枝汤兔血清经56℃，灭活30min后用于实验，发现正常血清及含药血清灭活后对病毒致细胞病变的抑制作用较灭活前均有所降低。灭活的血清对实验的不同影响，还取决于实验对象的选择，以及检验的目标[16]。可见，正常血清所含的抗体、补体等成分本身就有抗病毒作用。然而，用含头风饮（TFY）血清研究血清灭活的影响时发现，以抗血小板释放5-HT和阻滞内皮细胞钙通道作用为指标，血清灭活后使其药效作用非但没有降低，反而有所提高，但差异不明显，说明在这个实验中，血清在灭活对实验结果的影响不大，可能与实验所选动物、药材有关系。然而这3种灭活方法对不同实验，效果可能不同，周芝兰等人以豚鼠离体气管螺旋条抗乙酰胆碱及组织胺活性差异为指标，对血清预处理方法进行了比较，研究结果显示，经处理的血清均可非常明显地降低血清的抗乙酰胆碱作用，并且经丙酮处理的能明显降低血清的抗组胺作用，经56℃灭活血清不能降低其抗乙酰胆碱及抗组胺作用。还应注意，血清经长期的保存低温保存后药效会受到影响，所以进行血清药理实验时尽可能的使用保存时间较短的含药血清或刚刚制备的含药血清。

6 血清添加量

在用血清药理实验方法进行药理学观察时，必须注意到含药血清加入体外反应系统后，药物浓度将被稀释。在体外反应系统中适当的增加血清添加量是可以的，选择种属越接近动物的血清，添加的浓度可以越高，添加浓度为100%时，即在纯血清内培养。随着反应体系中含药物血清加入量的逐渐增加，其药理效应曲线是呈正态分布状，说明并不是添加量越大越好，血药浓度并不能与给药剂量呈倍数的提高，给药剂量加倍，血药浓度不一定加倍。而且还应考虑到受灌胃体积的限制。尽管不同的动物血清对细胞的影响是不同的，在进行细胞培养的时候，只选用一种血清也是可以的，既提供营养同时有作为药物的载体，而且可以避免多种血清产生的干扰。

7 小结

血清药理学是一门较新的体外实验方法，它优于传统的将中药粗制剂直接加入反应系的实验方法，对中药药理机制的研究具有推动作用，为中药复方的研究方法开辟了中药研究的新思路。尽管这些年人们做了大量研究，但由于起步较晚，还有许多问题，如给药方案、采血时间、血清的灭活等都需要探索和完善。中药血清药理学是针对中药及其复方的中药药理研究方法，用含药血清代替了传统的中药煎剂或提取物进行实验，其科学性更强，可信度更高。相信随着这门技术的日益成熟，中药血清药理学将会很好的发挥在科学研究和临床应用中的作用。

[1] 廖陶雪,方炳虎.中药含药血清药理学研究现状及应用于奶牛的探讨[J].广东奶业,2004(1)：28-31.

[2] 孙敬方.动物实验方法学[M].北京：人民卫生出版社,2001：110-126.

[3] 张开镐.依赖性药物药理效应的种属差异[J].中国药物依赖性杂志,2010,19(5)：413-415.

[4] 马晓红,丁艳蕊,王小琴.消瘤汤含药血清干扰细胞生长作用浓度的实验研究[J].湖北中医杂志,2008,30(2)：10-11.

[5] 王朔,李晓莉,唐泽瀛等.军事应激实验动物模型研究进展[J].武警医学院学报,2010,19(10)：834-836.

[6] 刘金玉,张玉,王凯平.当归多糖铁大鼠体内药动学参数与给药剂量的关系[J].中国医院药学杂志,2010,31(3)：183-185.

[7] 刘瑶,彭成.草乌煎煮时间、给药剂量与毒性的相关性研究[J].成都中医药大学学报,2008,31(1)：50-54.

[8] 张金明.唑来膦酸急性毒性试验研究[J].数理医药学杂志,2003,16(6)：526-527.

[9] 韦侃侃.药动学原理在临床给药方案中的应用[J].中外医疗,2009,28(8)：114.

[10] 陈奇.中药药效研究思路与方法[M].北京：人民卫生出版社,2005：30-33.

[11] 董淼伟.时辰药理学与临床合理用药[J].人民军医,2008,51(4)：241-243.

[12] 胡凯.地高辛药物浓度的检测及其临床应用[J].实验与检验医学,2010,28(5)：517-526.