蜂王浆组蛋白脱乙酰酶抑制物活性——10-HDA可能是蜜蜂极型分化的主要活性物质

由美国、中国和意大利的研究人员组成的研究小组最新研究发现，蜂王发育这一表观遗传现象可部分地归因于蜂王浆中含有的组蛋白脱乙酰酶抑制剂（HDACi）活性，而蜂王浆中的10-HDA可能是承担这一活性的主要物质。此研究是继蜂王浆含有的营养物质在级型分化中起作用之后，首次从表观遗传调控因子角度探索蜂王浆中起作用的活性物质。这一结果在线发表在今年2月18日的EMBO杂志上。

蜜蜂蜂王和工蜂间的分化是由于幼虫得到的食物不同而引发的。前三天，所有幼虫都食用蜂王浆。此后，工蜂幼虫的食谱开始以蜂蜜和花粉为主，而蜂王幼虫继续享用蜂王浆，并且得到充足的饲喂。这蜂王食谱使得蜂王与工蜂在形态、行为和生理方面都差别巨大，并且具有比普通工蜂长约20倍的寿命。这一食物摄入有多方面的影响：激活胰岛素信号级联反应，影响大脑释放激素，调控整体的表观遗传改变。蜂王浆在其中扮演着关键的角色。蜂王浆成分复杂，包括水、蛋白质类物质、脂肪酸、糖类、维生素和矿物质。到目前为止，对蜂王浆含有的在级型分化过程中起作用的物质的认识主要是蛋白质和糖类等营养作用成分。研究表明，蜂王表型是由表观遗传机制引起的。此课题组发现蜂王浆具有表观遗传活性，研究人员把承担这一活性的组分定位到了10-HDA。

在哺乳动物中，营养通过影响基因组的表观遗传状态，直接调控基因表达和发育。维持表观遗传状态的酶包括DNA甲基转移酶、组蛋白乙酰化酶和脱乙酰酶，以及组蛋白甲基转移酶和脱甲基酶。其中任何一种酶都能成为营养因子的靶标。对蜂王和工蜂大脑DNA甲基化模式进行比较，发现甲基化的CpGs数量没有差别，但甲基化位点却不尽相同，尤其是在外显子区，这就会影响可变剪接。此外，小干扰RNA导致的新孵化的蜜蜂幼虫Dnmt3水平的下降使得该幼虫发育成具有充分发育的卵巢的蜂王。因此，对蜜蜂幼虫注射Dnmt3 siRNA可以代替蜂王浆摄入对蜜蜂级型发育轨道产生的影响。这些研究表明蜂王浆的某组分有调控表观遗传途径的能力。该课题组根据RNA引起的蜜蜂幼虫Dnmt3水平的下降导致该幼虫发育成蜂王这一结果，推测蜂王浆具有调控DNA甲基化的活性。他们便利用K-ras-transformed NIH 3T3细胞报告系统检测2种浓度的蜂王浆（0.5%和1%）的表观遗传调控活性。发现这两种浓度的蜂王浆与一种DNA甲基化抑制因子——5-Aza作用相似。然后，用一个超滤膜分馏王浆中3 kDa的组分，试验表明其中＜3kDa低分子量的组分具有与5-Aza相似的作用。这一结果——以及蛋白激酶K处理王浆没有降低王浆此活性——表明蜂王浆具有表观遗传调控活性，且活性组分可能是一种非蛋白源的小分子。

接着，该课题组就把目标定到了蜂王浆中的小分子——10-HDA，因为它是蜂王浆的主要组分之一，占干物质的2%～6%，已有证据表明其在哺乳动物细胞具有生物学效力。于是，他们再一次利用K-ras-transformed NIH 3T3细胞报告系统，发现5mMd 10HDA溶液的确具有表观遗传调控活性。

为了证明10-HDA的表观遗传活性并非限于在K-ras-transformed NIH 3T3细胞报告系统，他们在第二个表观遗传报告系统——GF2-4细胞报告系统中检测了10-HDA的活性，这个系统基于重新激活一个具有高度CpG甲基化而沉默的GFP基因。他们单独用10-HDA或10-HDA与5-Aza的混合物分别处理细胞，发现10-HDA不能独自激活沉默的GFP位点，但能与5-Aza进行功能协同从而加强GFP位点的表达。进一步研究发现10-HDA与丁酸钠作用方式相似，丁酸钠是一个被广泛证明的HDACi。这些数据表明10-HDA本身不具有DNA脱甲基物质的功能，但是参与一个抑制基因转录的途径，这一途径与DNA甲基化途径平行。

他们又在第三个模型系统——SW48细胞（一个人类克隆癌细胞系）报告系统中进行了研究，结果得到了和第二个系统相同的结果，即10-HDA不能独自激活沉默的GFP位点，但可明显加强5-Aza激活GFP的能力。此外，在此细胞系，蜂王浆和10-HDA都能重激活表观遗传沉默的p21的表达。为直接检测10-HDA能否抑制DNA甲基化，他们对LINE-1（long interspersed nuclear element）重复元件进行测序，检测细胞整体的甲基化情况。结果，5-Aza处理组DNA甲基化水平降低了50%，而10-HDA不能独自降低LINE-1DNA甲基化水平，也不能增强5-Aza的效力。况且，蜂王浆处理（0.4%和4%，v/v）也没有对LINE-1元件的DNA甲基化水平产生影响。

他们又检测了10-HDA处理后CMV启动子的甲基化水平，发现没有降低。因此，10-HDA不是一个DNA甲基转移酶抑制物。那么，有可能10-HDA不是表观遗传因子的直接调控者，而是干扰超细胞信号调控激酶（ERK）或磷酸肌醇3激酶（PI3K）信号通路，从而把K-ras与表观遗传调控因子联系到一起。但试验发现10-HDA不对任何上述信号通路造成影响，表明10-HDA是直接靶向表观遗传影响分子。

基于10-HDA本身不能抑制DNA甲基化，但可与DNA脱甲基物质协同作用，而且与已知的HDACi复合物结构相似，他们又对10-HDA是不是一个HDACi进行了研究。结果显示10-HDA抑制了HDAC活性或推动了组蛋白乙酰转移酶活性。接着，体外实验直接检测到10-HDA和王浆确实具有抑制HDAC活性。需要注意的是，本实验用的蜂王浆含有2%的10-HDA，稀释100倍后10-HDA浓度为1mM，而稀释100倍的王浆溶液和1mM 10-HDA溶液功效相似，因此，推测蜂王浆中HDACi活性大部分是由10-HDA承担的。9-ODA是10-HDA的类似物，由蜂王产生，且其具有与HDACi相似的活性，因此9-ODA酸的活性也可能对蜂王表型的维持起到重要作用。

最后，他们再次利用K-ras-transformed NIH 3T3细胞报告系统，比较了TSA（一种HDACi）、丁酸钠和10-HDA的效力，以及用重组的HDAC1,3,8,10,11进行独立的抑制试验，一再证实了10-HDA的HDACi活性。

此研究试验设计比较严密，具有较大的说服力。但要证明10-HDA的确能对蜂王发育产生影响，笔者认为仍存在一些疑问需要进一步验证：（1）需要设计体内试验检测10-HDA是否对蜜蜂蜂王发育产生影响；（2）3龄后的工蜂食物中含有一定量的蜂王浆，需要检测工蜂食物中是否仍含有10-HDA；（3）如果工蜂浆中含有10-HDA，那是否对工蜂发育也产生影响？（4）如果10-HDA对工蜂发育和蜂王发育都产生影响，那调控方式差别是什么？是表观遗传数量的还是位点的差别？（5）虽然稀释100倍的蜂王浆溶液和1mM 10-HDA溶液功效相似，那蜂王浆除掉10-HDA后的组分，是否不具备HDACi活性？也就是说蜂王浆的HDACi活性是否仅有10-HDA承担？

浙江大学动物科学学院 陈璇 胡福良编译