农田杂草抗药性检测方法研究进展

董立尧, 吕 波, 徐江艳, 李 俊

(1.南京农业大学植物保护学院/农业部作物病虫害监测与防控重点开放实验室，江苏南京 210095； 2.南京农业大学理学院/江苏省农药学重点实验室，江苏南京 210095)



农田杂草抗药性检测方法研究进展

董立尧1，2, 吕 波2, 徐江艳1, 李 俊1，2

(1.南京农业大学植物保护学院/农业部作物病虫害监测与防控重点开放实验室，江苏南京 210095； 2.南京农业大学理学院/江苏省农药学重点实验室，江苏南京 210095)

杂草抗药性问题备受全球关注。文章通过检索国内外已报道的有关杂草抗药性的文献，对实验室常用的杂草抗药性检测方法进行了概述，并将杂草抗药性检测方法归纳为整株水平、器官或组织水平、细胞或细胞器水平以及分子水平，并对这些方法进行了简要分析，可为研究人员或农技推广人员根据快速、准确、经济等不同需要提供相应的杂草抗药性检测方法。

杂草； 抗药性； 检测

1942年2,4-滴的发现揭开了近代化学除草的新纪元。由于除草剂连续使用，很快导致了杂草抗药性的产生[1]。1950年在美国夏威夷的甘蔗田发现了多年生杂草竹节花(又称铺散鸭跖草，Commelinadiffusa)对2,4-滴产生了抗药性。从20世纪80年代开始，世界范围内大量应用除草剂，全球抗药性杂草的发展几乎呈直线上升。根据Heap统计，截至2010年10月，全球已有194种(114种双子叶，80种单子叶)杂草的348个生物型在各类农田系统对19类化学除草剂产生了抗药性[2]。抗药性杂草已成为杂草治理和农业生产的严重威胁，由其引发的严重经济和农业安全问题倍受全球关注。

随着杂草抗药性研究的不断深入，杂草抗药性检测方法也不断创新。1970年美国学者Ryan首次公开报道了欧洲千里光(SeneciovulgarisL.)对三氮苯类除草剂西玛津和莠去津产生了抗性，提出了整株植物测定方法，标志着杂草抗药性生物测定方法的诞生。随着科学研究的深入和科学技术的创新，杂草抗药性检测方法不断发展，出现了种子培养皿测定法、叶片叶绿素荧光测定法、DNA分析法等不同水平的检测方法。为了便于研究人员或农技推广人员在具体操作过程中根据快速、准确、经济等不同的需要选择适宜的检测方法，本文通过检索文献，归纳分析了目前比较常用的杂草抗药性检测方法。

1 常用杂草抗药性检测方法

1.1 整株水平测定方法

1.1.1 整株植物测定法 一般所使用的方法为Ryan法(1970)。基本操作：首先从长期单一使用某除草剂并怀疑有抗药性的田块及未使用过该除草剂的田块采集杂草种子，按小区大田播种或温室盆栽，在播后芽前或苗后进行常规施药处理。药剂设置不同剂量或浓度梯度，计算不同剂量下杂草的出苗率、死亡率、鲜重抑制率等指标，与对照比较，以确定抗药性水平[3]。2007年杨彩宏等利用整株植物测定法研究了江苏、安徽11个点油菜田日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵的抗药性，并用同样的方法进行了相关药剂交互抗性的测定，发现句容点的日本看麦娘对此药剂已产生明显抗性，并对芳氧基苯氧基丙酸酯类其他药剂产生了不同程度的交互抗性[4]。

1.1.2 幼苗检测法 该法基本操作：将怀疑对某种除草剂有抗药性及敏感的杂草种子分别放在盛有水的培养皿中培养，待根长至3～5 mm时，把带根种子转移到封闭瓶中的滤纸上，将不同浓度药剂溶液加到瓶中，在一定条件下培养，通过测量芽长或胚芽鞘长度测定杂草抗药性水平[5]。2002年Retrum等采用幼苗检测法研究了大狗尾草对烯禾啶的抗药性，发现该法可以有效地区分抗性和敏感种群[6]。

1.2 器官或组织水平测定方法

1.2.1 培养皿种子检测法 这种方法是把催芽的杂草种子放在加入药剂的琼脂平面或浸药的滤纸上培养，通过测定发芽数、主根长、鲜重等指标诊断抗药性水平。2007年杨彩宏等在油菜田日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵抗药性研究中也使用了培养皿种子检测方法，结果与整株植物测定法趋势一致，结果相符[4]。2008年丁君等采用培养皿种子检测法测定了再生烟草种子对苯磺隆的抗性，以及对烟嘧磺隆、噻吩磺隆、嘧硫草醚和莠去津的交互抗性，发现经苯磺隆抗性选育的再生烟草抗性显著提高，并且对这4种除草剂存在不同程度的交互抗性[7]。

1.2.2 分蘖检测法 该方法通常先将杂草种子种植在粗沙和泥炭(体积比为1 ∶3)的混合物中，在温室内培养至3叶期(第3叶未充分展开)时，选取正生长的分蘖，去根，然后放在一定的高浓度药剂溶液中，一段时间后，通过比较第3叶坏死程度来评价杂草的抗药性水平[8]。2000年Kim等在研究稗草对敌稗和精口恶唑禾草灵的抗药性时发现，根据分蘖的坏死程度可以快速检测抗性和敏感杂草生物型[9]。

1.2.3 花粉粒萌发法 按分蘖检测法种植杂草，剪取刚从颖片抽出的具花药的穗，把花粉震落到0.25%含一系列浓度除草剂的固体琼脂培养基上。在一定条件下培养一段时间后，用显微镜(200倍)观察花粉萌发情况。萌发花粉计数以花粉管长度至少达半个花粉粒长度为准。在时间和剂量的最适选择下，根据萌发花粉数的多少来判定抗性和敏感性生物型[10-12]。2007年Burke等用花粉粒萌发法研究了假高粱对ACC酶抑制剂类除草剂的抗药性，发现用烯草酮处理6 d后，抗性和敏感生物型在500 nm处的吸光度存在差异[13]。

1.2.4 叶圆片浸渍技术测定法 首先将叶圆片浸渍在含有一定浓度除草剂的磷酸缓冲溶液的试管中，抽真空，待叶圆块下沉至试管底部后，解除真空，加入少量碳酸氢钠溶液，照光。对除草剂不敏感或产生抗药性的生物型，光合作用未被抑制，组织间产生足够多的O2，叶圆片上浮；而对除草剂敏感的生物型，光合作用受抑制，不能产生足够多的O2，圆片仍沉在试管底部。根据一定时间内上浮的叶圆片数或上浮需要的时间来比较光合作用的强弱程度，以此来确定对除草剂敏感或抗性生物型[12,14]。

1.3 细胞或细胞器水平测定方法

1.3.1 叶片叶绿素荧光测定法 叶绿素荧光测定法机理是：在黑暗的条件下用闪光灯照射光合作用抑制剂类除草剂处理过的叶片时，光合作用抑制剂阻断电子由QA到QB的传递，光系统Ⅱ的还原端被中断，捕获的光能不能往下传递，叶绿素a处于激发态，以荧光的方式释放能量，通过测定叶绿素a发射荧光的强弱检测抗药性，抗性植株叶片表面的荧光强度小，敏感性生物型叶片表面的荧光强度大，所以，根据叶片表面的荧光强度，可区分抗药性生物型和敏感生物型[8]。1992年Lehoczki等用相同浓度的百草枯处理抗性和敏感性小蓬草生物型后，二者均快速表现出典型的百草枯药害症状，CO2固定和叶绿素荧光受到抑制、氧释放减少、已烷生成受到刺激，不同的是百草枯对敏感生物型的抑制不可逆转，而抗药性生物型植株在光照中得到恢复，而且光照强度的增加对叶绿素荧光的恢复作用非常明显[15]。

1.3.2 离体叶绿体测定方法 离体叶绿体测定法的研究证实了杂草抗药性是由于改变了类囊体膜上的光系统Ⅱ成分，从而改变了光系统Ⅱ还原端的电子传递反应。叶绿体的提取采用的是酶解法，离体叶绿体光还原反应的测定包括希尔反应和荧光反应。希尔反应是将叶绿体提取，放入希尔反应介质中，有氧化剂存在(DCPIC)时，在光照下会放出氧气，同时将氧化剂还原。荧光反应是通过测定叶片中荧光强度来鉴定光系统Ⅱ的功能。叶绿体荧光测定须在黑暗中进行，蓝色闪光照射叶绿体悬浮液，叶绿素发射荧光，用光电极管测定发射的荧光，并记录在X-Y记录仪上[3,8]。此外，还可以通过测定叶绿素含量的变化检测抗药性。1990年Joseph等的研究表明，野燕麦对苯氧羧酸类除草剂禾草灵的抗药性生物型和敏感性生物型叶片内叶绿素a和叶绿素b的含量表现不同[16]。

1.3.3 光合速率测定法 由于抗光合作用抑制剂生物型杂草在光合作用抑制剂处理后其光合速率变化不大，而敏感生物型则受到严重抑制，因此，通过测定光合速率的变化研究光合作用抑制剂对植物或叶片的影响，可以检测鉴定杂草抗药性。主要方法有红外线CO2测定法、氧电极测定法、pH比色法、气流测定法、改进的干重测定法和半叶法等[8]。1992年Preston等用百草枯处理敏感型大麦草，其体内光合作用氧气释放被抑制了66%，而处理抗性大麦草生物型后，除草剂对光合作用氧气释放的抑制作用不明显[17]。

1.3.4 呼吸速率测定法 测定方法可参照光合速率测定法[8]。

1.3.5 吸收和输导测定法 任何一种除草剂要发挥其除草活性，必须条件是这种除草剂能被杂草吸收并将足以发挥作用的剂量运输到作用部位。因此，除草剂在敏感杂草和抗性杂草体内的吸收和输导差异可用于检测杂草抗药性。Baerson等[18]和Lorraine-Colwill等[19]通过比较抗草甘膦的瑞士黑麦草和敏感的瑞士黑麦草生物型对草甘膦的吸收和输导，发现草甘膦在二者体内的输导差异明显，敏感型体内的草甘膦汇聚在植物的根，而抗性生物型体内的草甘膦则汇聚在叶尖，他们认为草甘膦在植物体内随蒸腾流快速向上移动后被泵入木质部，不能泵到韧皮部汇聚到生长点,即输导方向的改变是产生抗药性的原因。

1.3.6 酶活与代谢检测法 对于一些靶标已明确的除草剂，可通过测定靶标酶或与靶标酶催化的反应存在密切关联的酶的活性差异或某些代谢物质量的差异判断杂草抗药性。例如，乙酰乳酸合成酶(ALS)和乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂类除草剂在生产上应用广泛，作用位点均是细胞内的重要生化反应关键酶，通过作用于这些酶从而抑制细胞分裂，使组织失绿、黄化，植株逐渐死亡。因此，通过比较感抗生物型的ALS和ACCase相对活性的高低，便可以鉴定出抗药性生物型[20-21]。2004年de Prado等发现抗性绿色狗尾草体内的ACCaseⅠ对禾草灵的敏感程度比在敏感狗尾草中降低了30.8倍[22]。

此外，在若干杂草中，促进除草剂代谢解毒也是导致产生抗性的原因，此种代谢作用主要是促进细胞色素P450单加氧酶、葡糖基转移酶(GT)与谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)活性而产生[23]。2010年韩瑞娟等在日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵代谢抗性的初步研究中，发现了抗性生物型体内细胞色素P450还原酶和谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)的活性高于敏感日本看麦娘[24]。

1.4 分子水平检测方法

分子生物学方法包括酶联免疫方法、DNA分析法、RNA分析法等，在杂草抗药性研究中已得到广泛和成功的应用。

1.4.1 酶联免疫法 酶联免疫法[25](enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)始于20世纪70年代，是把抗原或抗体在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种固相载体表面。测定时，将受检样品和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物。反应终止时，固相载体上酶标抗原或抗体被结合，其量与标本中待检抗体或抗原的量成一定比例。经洗涤去除反应液中其他物质，加入酶反应底物后，底物被固相载体上的酶催化变为有色产物，最后通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量。2002年Reade等建立了田间酶联免疫测定看麦娘谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)丰度检测看麦娘对绿麦隆、异丙隆和精口恶唑禾草灵抗药性的技术[26]。

1.4.2 DNA(或RNA) 分析法 对于已经获知编码基因的除草剂靶标酶，可使用DNA(或RNA)分析方法判断杂草的抗药性。该法通常先提取基因组总DNA(或RNA)，再进行PCR扩增，然后对克隆的PCR产物进行测序，通过序列同源性分析便可检测杂草的抗药性。2008年Corbett等利用PCR-RFLP方法成功鉴定了抗性苋属杂草体内乙酰羟基酸合成酶(AHAS)的4处突变位点[27]。2009年卢宗志等采用PCR技术，分别对抗药性和敏感性雨久花生物型的ALS基因片段进行扩增和基因克隆，并对获得的DNA序列片断进行测序比对，与敏感性雨久花生物型ALS相比，抗药性雨久花生物型的ALS基因共有3处发生突变[28]。

2 杂草抗药性检测方法的分析与讨论

杂草抗药性检测方法多种多样，除了上面介绍的方法外，还有传统的田间观察法、小球藻法、愈伤组织和悬浮培养法、原生质体培养法等，但由于这些方法在实际应用中存在诸多不足，已很少使用。

从杂草抗药性检测快速、准确的要求考虑，可以选择分子水平测定方法。酶联免疫方法通过制备杂草产生抗药性过程中某些关键酶变化的单克隆抗体，可以灵敏、专一、微样、简单快速检测杂草的抗药性，该技术比其他检测方法表现出更多的优越性，灵敏度高、干扰小、安全性高、污染少，而且操作简便快捷。但它也存在一些缺陷，如不能同时分析多种成分，对试剂选择性高，对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应，对仪器要求严格，耗资大。DNA分析技术具有分析速度快、信息量大、准确度高等优点，但相对其他传统技术所需成本要高。因此，对于一些靶标已明确的除草剂，酶活与代谢检测方法能准确地检测出抗药性杂草生物型，同时还能进一步研究杂草抗药性机理的产生原因。

从杂草抗药性检测快速、经济的要求考虑，可以选择培养皿种子生测法，该法是幼苗生测法的改进，所需的植物培养时间较短，相对快速、廉价，尤其是对大量杂草种群的常规抗药性检测非常重要。但培养皿种子生测法要求供试的种子一定要有较高的发芽率和发芽势，否则会影响测定结果的可靠性。对田间正在生长的杂草，采用花粉粒萌发法可实现快速抗药性检测。

从杂草抗药性检测客观、经济的要求考虑，可采用整株植物测定法，该法操作简便，所需试验条件易于满足，田间和温室试验方法均易掌握，可用大批植株同时进行。但重复性较差，植物培养所需时间长。

从除草剂使用方式和作用机理的不同考虑，检测土壤处理的除草剂，可以采用幼苗检测法或培养皿种子检测法。检测茎叶处理的除草剂，可以采用整株植物测定法、分蘖检测法。检测内吸传导型除草剂，可以采用吸收和输导测定法。检测光合作用抑制剂类除草剂，可以采用叶片叶绿素荧光测定法、离体叶绿体测定法、叶圆片浸渍技术测定法或光合速率测定法。检测呼吸作用抑制剂类除草剂，可以采用呼吸速率测定法。

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Research Advance on Detection Methods for Weed Herbicide-resistance

DONG Li-yao1，2, Lü Bo2, XU Jiang-yan1, LI Jun1，2

( 1. College of Plant Protection,Nanjing Agricultural University/Key Laboratory of Monitoring and Management of Crop Diseases and Pest Insects,Ministry of Agriculture,Nanjing 210095,China；2. College of Science,Nanjing Agricultural University/Jiangsu Key Laboratory of Pesticide Science,Nanjing 210095,China)

The weed herbicide-resistance problem has become a global concern recently. In order to provide a rapid,accurate and economic detection methods for agricultural research and extension workers,documents concerning detection methods of weed herbicide-resistance reported at home and abroad were outlined and analyzed according to its research level on whole plant, organ or tissue,cells or organelles and molecular base respectively.

weed; herbicide-resistance; detection

2011-03-15

国家自然科学基金(编号:30971928)；江苏省农药学重点实验室2010年度项目。

董立尧(1960—)，男，博士，教授，从事除草剂毒理及抗药性研究。Tel:(025)84395672; E-mail:dly@njau.edu.cn。

S451

A

1003-935X(2011)02-0001-04

董立尧,吕 波,徐江艳，等. 农田杂草抗药性检测方法研究进展[J]. 杂草科学，2011，29(2)：1-4,9.