MicroRNA在肺癌诊断和治疗方面的研究进展

王 鹤（综述），王朝霞（审校）

南京医科大学第二附属医院肿瘤科，江苏 南京 210011

MicroRNA（简称miRNA）是非编码小RNA家族的成员之一，长度为18～25个碱基，通过碱基互补原理结合到靶基因mRNA的3'端非编码区（3'UTR），抑制mRNA的翻译或诱导其降解从而改变靶蛋白的表达水平。

1 miRNA的发现

miRNA在许多肿瘤中存在异常表达或突变现象，它们可能起到原癌基因和抑癌基因的作用，可以为肿瘤的诊断和生物治疗提供新的靶标。1993年，Lee等[1]首先在秀丽新小杆线虫发现miRNA这一家族的第一个成员lin-4。lin-14基因的突变使得线虫能够蜕皮，但只能停留在L1阶段，不能发育为成虫。lin-14编码一个核内蛋白，负责幼虫从L1阶段到L2阶段的细胞分裂。lin-4通过碱基配对的方式结合到靶基因lin-14的mRNA的3'UTR，抑制lin-14的翻译。2000年Reinhart等[2]发现了另一个类似的具有转录后调节功能的小分子RNA：let-7。随后，在多种生物物种中鉴别出上千种miRNAs。

2 miRNA的生物合成和功能

miRNA体内的形成过程大致如下：在细胞核内，首先由聚合酶Ⅱ或聚合酶Ⅲ转录合成pri-miRNA，由RNaseⅢ内切酶Drosha剪切得到约70个核苷酸的茎环型中间物premiRNA，在Ran-GTP和运输受体Exportin-5的共同作用下，pre-miRNA出核转运到胞浆，由另一种RNaseⅢ内切酶Dicer剪切加工，将茎环结构的pre-miRNA加工为双螺旋结构miRNA-miRNA。双链解开后，成熟的单链miRNA随后进入RNA介导的沉默复合物（RNA induced silencing complex，RISC）中。单链miRNA与RISC结合形成miRNP复合体后，miRNA通过与靶基因的3′UTR区互补配对，指导miRNP复合体对靶基因mRNA进行切割或者翻译抑制从而在转录后沉默基因，并通过细胞内复杂网络状调控体系，对生物体的发育、分化、增殖、凋亡、免疫调控等生理活动进行精确调节。

3 miRNA与肿瘤的关系

miRNA在许多肿瘤中存在异常表达或突变现象，推测它们可能起到原癌基因和抑癌基因的作用。且有研究表明，50%以上的miRNA定位在肿瘤相关基因组区域，包括LOH区、染色体扩增区及脆性位点等。通过对人肺癌、乳腺癌、胃肠癌、胰腺癌、肝癌等肿瘤组织miRNA表达谱的分析，发现每一种肿瘤都有众多特定的miRNA表达相对于正常组织发生变化，让越来越多的科研人员将研究重点转移到miRNA与肿瘤发生的密切关系上。

4 miRNA在肺癌诊断中的作用

肺癌是癌症相关性死亡的头号杀手，总的5年生存率不到15%，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌病例的80%以上，由于大多数患者在患病早期没有明显的症状，确诊时多已进入中晚期阶段，治疗效果及预后较差。但研究显示Ⅰ期NSCLC患者术后5年生存率达到83%，所以早发现，早诊断仍是肺癌治疗的关键。miRNA的表达具有时空特异性。在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异，这种miRNAs表达模式具有分化的位相性和时序性。miRNA的表达谱，不仅指miRNA的种类，也指各种miRNA的丰度，直接反映了细胞组织的分化发育状态。miRNA在不同肿瘤中具有特定的表达模式，这为肿瘤的基因诊断提供了一种新方法。

Jiang等[3]在52例非小细胞肺癌病例中发现has-miR-125a-3p和has-miR-125a-5p（分别位于pre-miR-125a的3′端和5′端的两种成熟MicroRNA）在癌组织中均比周围正常组织表达低。本课题组利用miRNA芯片技术，获得了NSCLC的miRNA表达图谱，并通过荧光实时定量PCR鉴定了40个差异表达的miRNAs[4]。结果发现，与正常组织相比较，在非小细胞肺癌组织中miR-451表达显著降低。Yu等[5]利用RT-PCR分析 112例非小细胞肺癌患者组织 miR-21、let-7a、miR-137、miR-182和miR-372的表达情况，发现可以利用这些microRNA的综合表达情况来对患者进行诊断。

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，SNP自身的特性决定了它在遗传性疾病研究中具有重要意义。Tian等[6]在中国1058例肺癌患者和1035例正常对照组检测miR-196a2 SNP rs11614913发现，突变型纯合子CC较杂合子TC及野生型纯合子TT的肺癌易感性提高了约25%。Chin等[7]发现在每年吸烟少于40包的非小细胞肺癌患者中，miR-let-7与其靶基因KRAS的3′UTR的完全匹配区的第6位点（LCS6）等位基因突变率为18.1%～20.3%，而正常人仅为5.8%；另外，体外研究发现LCS6发生突变的miR-let-7，相应地出现KRAS表达增高，提示miR-let-7 LCS6突变可以作为此类非小细胞肺癌诊断的易感指标。Xiong等[8]对666例小细胞肺癌与758例正常对照组比较发现，miR-18273′UTR的rs3134615的基因型与小细胞肺癌的易感性相关，相对于GG基因型，GT、TT基因型的优势比为2.08。

随着肺癌生物靶向治疗的发展，对于非小细胞肺癌的精确分型显得尤为重要。对122例非小细胞肺癌标本（62例鳞癌，60例腺癌）进行表达谱分析及qRT-PCR验证的方法发现has-miR-205在非小细胞肺癌的腺、鳞癌分型中，对鳞癌的敏感性达96%，特异性达90%[9]。Raponi等[10]运用交叉验证分析，证明了miR-146b诊断鳞癌具有很高的精确性。Yu等[11]对肺腺癌痰液的miRNA表达谱分析及验证发现，miR-21、miR-486、miR-375、miR-200b对于区分肺腺癌与正常人的敏感性及特异性分别达到80.6%、91.7%。

外周血液循环中miRNA表达谱的变化作为有前景的诊断工具已经越来越受到人们的关注。Heegaard等[12]对220例早期非小细胞肺癌与对应的正常组的血清及血浆miRNA检测发现， 血清中 miR-146b、miR-221、let-7a、miR-155、miR-17-5p、miR-27a和 miR-106a较正常组表达显著下降而miR-29c显著增高；血浆中miR-let7b与不良预后存在密切关系，miR-223特异性表达于NSCLC IA/B期。对肺癌不同时期的904个血清miRNA分析发现，伴随肺癌的发生发展，存在不同时期的特异miRNA谱。对400例NSCLC患者与220例正常对照组血清miRNA进行qRT-PCR及危险评分提示，10个血清miRNA可高特异性、高敏感性诊断早期非小细胞肺癌[13]。Foss等[14]发现 miR-1254、miR-574-5P 作为早期肺癌的诊断指标，敏感性与特异性分别达82%、77%。

5 miRNA在肺癌治疗中的作用

生物体通过多层次、精确的内部调节机制，完成发育、分化、代谢等各项正常的生理活动。一旦这些调控系统出现紊乱，细胞失去对分化、增殖、凋亡等过程正确及时的调控，正常的组织形态就会出现恶性转化，导致肿瘤发生。miRNA作为原癌基因或抑癌基因，参与上述过程的调控，与肿瘤的靶向生物治疗存在密切关系。

5.1 与增殖相关的miRNA与肺癌治疗

在香港女性中，非吸烟肺腺癌患者中70%的患者存在EGFR突变。研究发现，转染has-miR-145可抑制存在EGFR突变的肺腺癌细胞株HCC4006、NCI-H1975、NCI-H1734的增殖。miR-192通过调控靶基因RB1可增强肺癌细胞增殖[15]。miR-182通过靶作用于CTTN能抑制A549肺癌细胞株增殖[16]。miR-145可通过下调EGFR、NUDT1和c-myc的表达抑制肺癌细胞增殖[17-19]。 miR-93、miR-98、miR-197 通过下调抑癌基因FUS1的表达而起到抑制肺癌生长、发展的作用且与肺癌患者总体生存率密切相关。miR-let-7a可通过靶作用于NIRF上调P21WAF1的表达而抑制肺腺癌A549细胞增殖。体内研究发现，miR-let-7a通过抑制KRAS和c-myc的表达来抑制裸鼠肺癌生长[19]。

5.2 与细胞周期相关的miRNA与肺癌治疗

Liu等[20]发现，肺癌中在细胞水平过表达miR-126通过靶作用VEGF使A549、Y-90与SPC-A1等细胞株细胞周期停滞在G1期，抑制肿瘤细胞的生长；在活体水平，慢病毒转染miR-126的A549细胞株接种的裸鼠体重较对照组下降22.4%。Bandi等[21]发现，在非小细胞肺癌中，生理浓度的miR-15a、miR-16以 Rb依赖的方式靶作用于 CCND1，CCND2，CCNE1而使细胞周期停滞在G1期。另一项研究[22]显示miR-107、miR-185同样具有使细胞周期停滞在G1期的能力，尤其是miR-107；PCR及免疫印迹的方法证实CDK6为miR-107、miR-185 靶基因。 下调 miR-21、miR-16、miR-181a表达使A549细胞株细胞周期停滞在S期从而抑制其生长。

5.3 与凋亡相关的miRNA与肺癌治疗

Liu等[23]发现过表达的miR-494下调anti-BPDE诱导的肺癌细胞株16HBE中PTEN的表达；过表达的miR-494抑制caspase3/7的活力，而低表达miR-494则可降低肺癌细胞的恶性程度。Crawford等[24]通过表达谱分析发现肺癌与肺癌周围正常组织比较，miR-133B下调程度最大 （28.62倍）；通过荧光素酶报告实验证实miR-133B的下游靶基因为MCL-1、BCL2L2/BCL-W（两者均为BCL-2家族抗凋亡蛋白）。过表达miR-133B沉默MCL-1和BCL2L2的表达联合吉西他滨（非小细胞肺癌一线化疗药物且可通过BCL-2家族诱导凋亡）可诱导肺癌细胞株H2009的凋亡。另一项研究发现[25]，无论是否吸烟、EGFR是否突变（突变型对EGFR-TKI敏感），低表达miR-21联合EGFR-TKI都可诱导肺癌细胞的凋亡，提示miR-21可能成为肺癌靶向治疗的有效靶点。过表达miR-192通过靶作用于RB1，激活caspase-7、PARP诱导肺癌细胞凋亡[15]。

5.4 与耐药相关的miRNA与肺癌治疗

近年来，肿瘤耐药的问题逐渐成为人们关注的热点。PC9/AB11细胞株（起源于PC9细胞株的耐吉西他滨肺腺癌细胞株）与PC9细胞株比较发现，两者的细胞倍增时间、细胞周期分布、半数抑制浓度（IC50）存在显著性差异；miRNA表达谱分析比较发现miRNA同样存在差异性表达[26]。体内外研究发现，肺癌中过表达miR-135a可导致紫杉醇耐药，部分通过下调APC实现。研究发现，过表达的miR-451通过AKT通路作用可使肺癌细胞株A549对顺铂（cisplatin，DDP）的敏感性增加[27]。 Garofalo等[28]发现，在肺癌中，miR-221/222通过抑制靶基因PTEN和TIMP3的表达导致TRAIL耐药。上调miR-7的表达可通过下调EGFR通路蛋白的表达，增强喉鳞癌细胞株SQ20B、乳腺癌细胞株MDA-MD-468、肺癌细胞株A549、恶性胶质瘤细胞株U251和U87的放疗敏感性；相反下调miR-7的表达可通过上调EGFR及其下游分子的表达，降低恶性胶质瘤细胞株U251的放疗敏感性[29]。受LIN28B调控的miR-let-7g通过下调KRAS可增强肺癌对电离辐射的敏感性。

5.5 与侵袭、转移相关的miRNA与肺癌治疗

肺癌治疗的一大难点就是难以防治肺癌全身多处转移。对肺正常组织、肺癌组织、肺正常支气管上皮细胞株、肺癌细胞株的miR-206的real time PCR发现，miR-206的表达与肺癌的侵袭性呈负相关[30]。miR-328、miR-330-3P可用于鉴别非小细胞肺癌是否发生脑转移；而且，miR-328部分通过上调PRKCA表达使非小细胞肺癌具有侵袭、转移能力[31]。Garofalo等[28]发现，miR-200通过抑制EMT过程从而抑制肺癌侵袭、转移。miR-221/222通过靶作用于PTEN和TIMP3，诱导肺癌转移。miR-182通过靶作用CTTN抑制肺腺癌A549细胞侵袭[16]。miR-let-7g通过靶作用HMGA2下调E2F1抑制肺癌细胞株A549转移[32]。miR-125a-5p通过EGFR通路负性调控肺癌细胞侵袭、转移。

6 小结

在肺癌领域中miRNA的研究尚处于起步阶段，利用miRNA进行肺癌诊断和治疗还有许多尚未解决的问题。区别正常组织与肿瘤组织、有利于肿瘤的分期及分型的特征性miRNA谱有待于进一步研究。miRNA可起抑癌或致癌作用，如何针对致癌miRNA设计反义分子，进而导入高效特异表达致癌miRNA反义分子及抑癌miRNA并解决免疫排斥等安全性要求是我们需要思考的问题。基础研究中很多miRNA的功能及其靶基因还没被认识；大多数研究关注的是miRNA对靶基因的调控作用，而忽视了对miRNA基因表达的调控机制以及不同的miRNA之间是否有相互作用等的研究。笔者相信，随着上述问题的解决，不久的将来miRNA将会为肺癌的诊治带来革命性的进展。

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