HPLC法测定己酮可可碱葡萄糖注射液中5-羟甲基糠醛限量

李启彬 李青丽

HPLC法测定己酮可可碱葡萄糖注射液中5-羟甲基糠醛限量

李启彬 李青丽

目的采用HPLC法测定己酮可可碱葡萄糖注射液中5-羟甲基糠醛限量。方法ODSC18柱(250×4.6mm,5μm),以甲醇 ∶水 ∶三乙胺(50∶50∶0.1)为流动相,检测波长为 284nm。结果回归方程 A=4100.91+53467.52C(r=0.999,n=5),在浓度 1μg/ml～20μg/m l的范围内线性良好,加样回收率为 99.89%,RSD=0.19%。结论本方法准确而灵敏,能有效地控制 5-羟甲基糠醛的限量。

己酮可可碱葡萄糖注射液;5-羟甲基糠醛;HPLC

己酮可可碱为一种甲基黄嘌呤类血管扩张剂,临床用于缺血性脑血管疾病、血管性头痛和血栓闭塞性脉管炎的治疗。己酮可可碱葡萄糖注射液为含己酮可可碱和5%葡萄糖的灭菌水溶液。其中葡萄糖降解产物 5-羟甲基糠醛(5-HMF)的控制是重要的质量指标,限度应不低于中国药典中葡萄糖注射液的限度要求。但按照文献[1]方法采用分光光度法于 284nm处直接测定 5-HMF时,由于己酮可可碱在此波长有最大吸收,对测定产生干扰。笔者采用高效液相色谱法测定己酮可可碱葡萄糖注射液中 5-HMF的限量,以提高检测的准确度及灵敏度。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪:SSITP420;检测器型 号:SSI500DETECTORVariable UV/VIS;己酮可可碱:上海申兴药厂提供(批号:20000105);5-HMF对照品:美国 Sigma公司提供(批号:H 9877);己酮可可碱葡萄糖注射液:南京小营制药厂提供(批号:00052001、00052002、00052003);甲醇 (色谱纯);三乙胺(分析纯)。

2 结果

2.1 色谱条件 色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶 250mm×4.6mm;流动相为甲醇:水:三乙胺(50:50:0.1);流速:1.0m l/min;检测波长:284nm。

2.2 标准储备溶液的配制 精密称取 5-HMF对照品 12.5mg,置 25ml容量瓶中,加水溶解并稀释置至刻度,摇匀,使成 0.5mg/m l的标准储备液,备用。

2.3 系统适用性试验 取 5-HMF标准储备溶液 10μl,注入高效液相色谱仪中,记录色谱图,根据保留时间tR和半高峰宽(W 1/2h)计算色谱柱的理论板数。理论塔板数 n=5.54(tR/W 1/2h)2以 5-HMF计算,n=14029。

2.4 标准曲线的制备 精密量取 5-HMF标准溶液 0.2m l、1m l、2ml、3ml、4ml分别置于 100m l容量瓶中,加水分别制成1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml的溶液。按上述色谱条件进行测定,记录峰面积。以峰面积均值 A对其浓度 C线性回归,得到回归方程 A=4100.91+53467.52C,(r=0.9999,n=5)。结果表明,5-HMF在浓度 1μg/ml～20μg/ml的范围内线性良好。

2.5 检测限的确定 检测限是指试样中被样检测物能被测出的最低量。检测方法为信噪比法,即:将低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较,算出能检测出的最低浓度或量。一般以信噪比为 3:1或 2:1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。精密称取 5-HMF10mg,以流动相稀释至 50m l,制备成浓度 200μg/ml的高浓度溶液,再分别稀释制成 20μg/ml和 40μg/ml的溶液。取三种样品各 10μl注入高效液相色谱仪中,信噪比符合 3:1或 2:1的样品浓度即为 5-HMF的检测限。

2.6 精密度试验 取5-HMF标准储备液配制成 5μg/ml的溶液,重复进样 5次,测定5-HMF面积积分值,代入标准曲线计算浓度,并计算出RSD=0.22%。

2.7 稳定性试验 由于采用本品注射液直接进样,因此方法学研究中无需考虑本项内容。

2.8 重复性试验 取同一批样品,重复测定 5次,RSD=0.76%。

2.9 回收率测定 精密量取已知 5-HMF限量的同一批己酮可可碱葡萄糖注射液 1ml,共 9份,分别精密加入 5-HMF标准储备液 10μl、20μl、30μl,摇匀。各取上述溶液 10μl,分别注入色谱仪,记录色谱图,计算回收率。

2.10 样品的测定 样品中 5-HMF的限度确定:根据中国药典 2005版二部葡萄糖注射液检查项下对 5-HMF的限度要求,取 5-HMF对照品适量,加水制成在 284nm吸收度为0.32的溶液,照上述测定方法测定,代入标准曲线计算浓度和含量,计算结果 5-HMF含量为 12.5μg/m l。故样品中 5-HMF的限量应为 12.5μg/ml。样品中 5-HMF的含量测定:精密量取己酮可可碱葡萄糖注射液样品10μl注入高效液相色谱仪,按上述色谱条件,记录色谱图至主分峰保留时间的2倍,测得 5-HMF的色谱峰面积;另精密量取5-HMF标准储备液 1.25ml置 50m l容量瓶中,加水稀释至刻度,药匀,得浓度为 12.5μg/ml的对照品溶液。精密取 10μl注入高效液相色谱仪中,同法测定峰面积,除空白溶液峰和其他杂质峰外,按峰面积外标法计算。

3 讨论

对于以葡萄糖为载体的输液剂,国内外药典多采用 284nm测定吸收度的方法控制产品中 5-HMF量,浓度不同,吸收度的限度不同。紫外分光光度法因简单、通用、无需对照品而作为首选方法。但本品主药己酮可可碱对检测有干扰,故采用 HPLC外标法,按照中国药典中葡萄糖注射液限度要求,用对照品进行限度等量转换试验,以确定合适的 5-HMF限量。笔者认为,HPLC法测定己酮可可碱葡萄糖注射 5-HMF的限量准确性高、灵敏度及重现性好,是控制己酮可可碱葡萄糖注射液中 5-HMF限量的行之有效的方法。

[1] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(II)部.北京:化学工业出版社,2005:692.

463000驻马店市食品药品检验所(李启彬);河南天方药业股份有限公司(李青丽)