独活乙醇提取物对环氧化酶的影响

邱建波，徐 清，姜笑寒

广东省食品药品职业技术学校，广东广州 510663

独活为伞形科植物重齿毛当归（Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan）的干燥根，其主要功能是祛风除湿，通痹止痛。用于风寒湿痹，腰膝疼痛，少阴伏风头痛，风寒挟湿头痛[1]。独活的化学成分主要有香豆素类和挥发油类[2-4]，以香豆素类为主，治疗风湿多泡酒饮用。本研究拟通过独活的乙醇提取物在体外对环氧化酶（包括COX-1和COX-2）活性的影响来探讨其祛风湿的可能作用机制，为独活的临床应用和组方选药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

动物：SD雄性大鼠，体重180～220 g，购自中山大学实验动物中心。

药物：称取粉碎的药材，加入适量95%乙醇室温浸泡过夜，用索氏提取器提取1 h，减压蒸干溶剂，用二甲基亚砜（DMSO）溶解残留物，15 000 r/min离心 10 min，取上清，定容使其终浓度为1 g/ml（每毫升含1 g生药），热压灭菌后，-20℃保存备用，实验前用DMSO稀释成相应浓度。

试剂：RPMI 1640干粉购自Gibco公司；花生四烯酸（AA）购自 Cayman 公司；脂多糖（LPS）购自 Sigma公司；胎牛血清（FCS）购自杭州四季青公司；塞来昔布（Celecoxib），辉瑞公司惠赠；吲哚美辛，为标准品，购自中国药品与生物制品检定所；PGE2和6-keto-PGF1α放免试剂盒购自解放军总医院东亚放免研究所；其他试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 COX-1和COX-2模型的建立 参照文献[5]方法制备大鼠腹腔巨噬细胞COX-1和COX-2模型。大鼠腹腔注射0.4%明胶4～5 ml，4 h后，击头处死大鼠。用冷Hanks液灌洗腹腔，每只10 ml，收集灌洗液，灌洗 3次，1 500 r/min离心5 min，RPMI-1640洗涤2次。调整细胞数为106个/ml，接种至96孔培养板，每孔0.2 ml。在37℃，5%CO2培养箱培养2 h，洗去未贴壁细胞，继续培养24 h后，换0.5%FCS的RPMI-1640培养基培养24 h，作为COX-1模型。在此基础上，再以10%FCS的RPMI-1640培养30 min，加入阿司匹林（终浓度1 mmol/L），继续培养30 min后，弃上清，PBS冲洗。再加入0.5 μg/ml LPS 的 10%FCS 的 RPMI-1640 培养液 200 μl，继续培养6 h后，作为COX-2模型。

1.2.2对COX-1的影响 在COX-1模型的细胞培养液中加入独活，使其终浓度分别为 0.1、1、10 g/L；或塞来昔布（COX-2选择性抑制剂阳性对照，终浓度1×10-6mol/L）、吲哚美辛（COX-1及COX-2抑制剂阳性对照，终浓度1×10-7mol/L）； 或阴性对照溶媒 DMSO，37℃，5%CO2培养箱培养 30 min，加入底物 AA，使其终浓度为 10 μmol/L，继续培养 20 min。取上清按试剂盒要求测125I-6-Keto-PGF1α的放射活性。以PGF1α生成减少的百分率来反映药物对COX-1活性的抑制作用。抑制率（%）=（对照组PG浓度-给药组PG浓度）/对照组PG浓度×100%

1.2.3 对COX-2的影响 在COX-2模型的细胞培养液中加入独活、塞来昔布、吲哚美辛或阴性对照溶媒，所用药物的浓度与COX-1相同。37℃，5%CO2培养箱培养30 min，加入底物AA，使其终浓度为10 μmol/L，继续培养20 min。取上清按试剂盒要求测PGE2的放射活性。以PGE2生成减少的百分率来反映药物对COX-2活性的抑制作用。抑制率的计算公式同上述COX-1。

1.3 统计学处理

数据用SPSS 11.0统计软件处理，所有结果用均数±标准差（±s）表示，比较采用独立样本t检验。

2 结果

塞莱昔布仅对COX-2有抑制作用，对COX-1的抑制作用与对照组比较差异无统计学意义；而吲哚美辛对COX-1和COX-2都有抑制作用。独活则对COX-1和COX-2都有不同程度的抑制作用，并且可以发现抑制率随剂量的增加而增大，存在一定的量效关系。另外，在剂量相同时，独活对COX-2的抑制率大于COX-1。见表1。

3 讨论

前列腺素（PGs）是一种与炎症紧密相关的重要介质，COX为PGs生物合成的重要限速酶，随着COX-2的发现，现在普遍认为COX-1为结构型，它产生的PG参与机体正常生理过程和保护功能，而COX-2则是为诱导型，是经刺激迅速产生的诱导酶，参与炎症反应，抑制COX-2可以发挥抗炎作用[6]。本研究采用的是基于大鼠腹腔巨噬细胞的COX-1/-2抑制剂筛选模型[5,7]。在该模型中，低血清（0.5%FCS）的RPMI-1640培养时，COX-2不被诱导，只有COX-1起作用，这时加入底物AA，测定培养基中125I-6-Keto-PGF1α的浓度，可用于COX-1活力的测定。巨噬细胞受LPS诱导后，开始表达COX-2，而COX-1活性很低，利用阿司匹林乙酰化COX-1，使COX-1失去活性，这时加入底物AA，测定培养基中PGE2的浓度，可用于COX-2活力的测定。独活的主要功能是祛风除湿，通痹止痛，在临床上主要入复方治疗骨性关节炎[8]和类风湿性关节炎[9]。本实验表明，独活在3个不同剂量都对COX-2有抑制作用，并随剂量的增加而作用有增强的趋势，推测抑制环氧化酶可能是其祛风湿的作用机制之一。

表1 独活对COX-1和COX-2的影响(±s，n=3)

注：与 DMSO 比较：*P＜0.05，**P＜0.01

药物 剂量 PGF1α(μg/L) 抑制率(%)PGE2(μg/L) 抑制率(%)DMSO塞来昔布吲哚美辛独活--10-6mol/L 10-7mol/L 0.1 g/L 1 g/L 10 g/L 3.89±0.74 3.53±0.81 1.65±0.34**2.78±0.65 2.24±0.42*1.91±0.46*-95 8 29 42 51 82.32±8.84 46.43±5.75**36.26±5.42**53.38±8.51*38.02±7.73**26.69±8.36**44 56 35 54 68

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版一部[S].北京：中国医药科技出版社,2010：246.

[2]张才煜,张本刚,杨秀伟.独活化学成分的研究[J].解放军药学学报,2007,23(4)：241-245.

[3]杨秀伟,郭庆梅,张才煜,等.独活化学成分的进一步研究[J].解放军药学学报,2008,24(5)：389-392.

[4]丁希飞,冯煦,董云发,等.中药独活化学成分的研究[J].中药材,2008,31(4)：516-518.

[5]潘献柱,王林,程洁,等.选择性环氧合酶-2抑制剂体外筛选模型的建立[J].中国新药杂志,2006,15(23)：2024-2027.

[6]Marx J.Anti-inflammatories inhibit cancer growth--but how[J].Science,2001,291(5504)：581-582.

[7]潘献柱,汪晓庆,谢琳琳,等.选择性环氧合酶-2抑制剂筛选模型的验证[J].安徽医药,2009,13(8)：879-881.

[8]吴国芬.独活寄生汤加味内服外洗治疗膝关节骨性关节炎[J].浙江中医药大学学报,2010,34(2)：205-206.

[9]杨新玲,宋晓莉.独活寄生汤治疗类风湿性关节炎68例[J].陕西中医,2010,31(4)：439-440.