阿尔茨海默病转基因小鼠的行为学检测方法

李子艳，马慧冬

内蒙古乌海市人民医院，内蒙古乌海 016000

阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease,AD）是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍。本文主要是对目前国内外常采用的AD转基因小鼠行为学测试方法作一综述。

1 Morris水迷宫实验（Morris water maze）

Morris水迷宫是由英国心理学家Morris于20世纪80年代初设计发明的，是目前最可靠有效的检验动物行为记忆功能的方法。这种装置可观察并记录动物入水后搜索目标所需的时间、采用的策略和它们游泳的轨迹，有助于分析和推断单位的学习、记忆、空间定向和认知功能等方面的能力。目前广泛运用在神经生物学领域的基础和应用研究中。

Morris水迷宫实验装置是一个直径约1 m的圆形水池，水池直径的大小因实验者的习惯或实验动物的大小而不同。填充物为不透明液体，如牛奶或其他人工合成的不透明剂。实验将水池分为4个象限，在目标象限中央液面下1~2 cm的位置放置一个直径约为10 cm的圆形平台。一般将池内的液体的温度控制在25℃左右。

实验设计为两个阶段：定向航行实验 （place navigation test）和空间探索实验（spatial probe test）。定向航行实验是学习阶段，一般进行4~9 d，每天训练4次。每次将实验动物随机选择一个象限面朝池壁放入水池中并开始计时，实验动物找到目的象限中隐藏平台所用的时间，即为逃避潜伏期。每次训练时间限制为60 s或120 s，找到平台后允许动物在台上休息10~30 s，若实验动物在限制时间内没有找到平台，则帮助其找到平台，逃避潜伏期记为限制时间。由计算机视频软件系统自动跟踪记录逃避潜伏期、游泳速度、绘制游泳轨迹等。空间探索试验是记忆阶段。此阶段撤去目的象限隐藏的平台，让实验动物在限制时间内在水池中自由游泳，计算机记录动物在各象限时间、穿越平台位置次数、游泳速度、绘制轨迹图等[1-4]。第四象限时间和穿越平台次数是最有意义的观察指标。Morris水迷宫检测的是动物的空间参考记忆最为经典的行为学检测方法。

之后的研究者在传统方法的基础上又进行了很多改进，如Markowska[5]发现动物学习阶段将平台设计为间歇地出现，这种方法可更加有效地检测动物的空间参考记忆能力。Arteni[6]在水迷宫中采用了两个隐藏平台，轮流升起不同平台的方法还可以检测动物的工作记忆。Morris水迷宫广泛用于啮齿类动物的视觉相关的空间记忆和工作记忆的检测中，但对于检测动物长时程记忆的可靠性仍存在争议。

2 高架十字迷宫实验（elevated plus-maze test）

高架十字迷宫实验室检测动物焦虑情绪和活动能力的行为学方法，被广泛应用在抑郁症、痴呆等疾病模型的相关研究中。迷宫的基本装置主要由呈十字交叉的两条开臂（50cm×10 cm×10 cm）和两条闭臂（50 cm×10 cm×40 cm）组成，迷宫的底部距离地面50~100 cm不等。四条臂的内部均漆成黑色，室内保持安静暗光。动物从四条臂的交叉区域面向闭臂放入。计算机视频软件系统自动记录动物的活动情况，实验时间为5 min。

实验主要观察的数据包括：闭臂和开臂进入次数（至少两只前爪进入臂内）和停留时间。并计算动物进入开臂的次数和在开臂滞留时间分别占进入两臂总次数和总时间的百分比[7-8]。高架十字迷宫是利用动物对新异环境的探索性和对高悬敞开臂的恐惧，测试动物在复杂环境中的自主活动能力和焦虑程度。动物进入开臂的次数和在开臂滞留时间越长，说明动物的自主活动能力越高，而焦虑程度越低。许多研究发现AD转基因小鼠在高架十字迷宫中表现出焦虑程度增加，自主运动能力降低。

3 开场实验(open field test)

开场实验同样可以检测动物的焦虑程度和自主活动能力。实验装置主要为一60 cm×60 cm×40 cm大小的顶部开口的箱体。箱底内面被平均划分为25个方格，靠近箱壁一圈的方格称之为外周格，靠近内部的方格称之为中央格。实验将动物放入正中一格，计算机视频软件系统记录5 min内动物的活动情况。实验时间一般设定在7∶00~12∶00 am，2次实验之间将箱底打扫干净。

实验主要观察的指标为爬行格子总数和中央格爬行时间。龋齿类动物喜欢在黑暗的角落环境活动，宽敞明亮的环境会使其焦虑程度增加。在开场实验中爬行格子总数反映小鼠的自主活动能力，中央格停留时间可以衡量小鼠的焦虑情绪。研究表明AD转基因小鼠在旷场实验焦虑程度增加，爬行格子总数减少，中央格爬行时间缩短[9-12]。

4 放射状迷宫实验

放射状迷宫实验放射性迷宫最先由Ohon和Samuelson于1976年应用于动物的空间记忆研究，之后在行为学研究中得到广泛应用，实验方法也得到不断改进。

实验装置由一个中央平台和多条放射臂组成，放射臂的数目不定，多为8条臂。臂长多为50~60 cm，臂宽10 cm，臂的末端放置一个食物盒，迷宫放置在距离地面50 cm高度实验场所中设计一些外形明显的物体作为动物空间参照目标。常用的实验方案有以下3种：①所有的臂上的食物盒中都放有食物，把实验动物放置在中央平台上，记录动物进入放射臂的正确次数（未探索过的臂）及错误次数（已探索过的臂）。此方案主要反映了动物的工作记忆；②同样在所有的臂上食物盒都放有食物，记录探索完所有臂需要的总次数（最大25次），按公式（day2+day3+day4+day5）－4×day1 的计算结果。 评估与海马皮层功能相关的空间记忆；③部分放射臂中的食物盒中放置食物，记录动物进入放射臂的正确次数（进入有食物的臂）和错误次数（进入没有食物的臂），此方案主要反映了动物的空间记忆[9]。

部分研究将实验中促使动物完成实验的奖赏性措施（食物）换为厌恶性刺激，如放射臂水迷宫（Radial Arm water Maze）[13-14]。实验装置包括一个直径100 cm不等的圆形水池，多为6个放射状分布的游泳臂，在某一臂的末端放置一逃避平台。一天进行4次学习实验，每次约1 min。每次学习实验小鼠被放在没有放置逃离平台的臂内——开始臂。下次实验应重新随机选择另一个开始臂，每个臂只能选择一次。记录小鼠探索的错误次数（如果小鼠探索错误，将会被放回开始臂重新进行探索）。1 d的4次学习实验中，小鼠错误次数的减少作为学习实验的数据。结束后，将小鼠放回窝30 min，再以第4次学习实验相同的开始臂进行一次记忆实验。

5 T型迷宫实验

T型迷宫是检测动物空间学习、工作记忆、交替行为的行为学检测方法，广泛应用于AD转基因鼠的行为学研究中。T型迷宫通常为两条等长的垂直通道，形状如T型。每条通道除底面为黑色外，其他三面由透明树脂组成。通道尺寸一般为75 cm×12 cm×20 cm，其中竖直通道的末端用不透明活动门隔出一通道作为实验动物的起始位置。水平通道的两端分别作为两个目标位置，在由竖直通道进入水平通道的入口处分别有两扇不透明活动门，可以通向通道左右两侧方向，实验者可以控制活动门的开放。实验场所放置外形明显的物体作为视觉参照物。实验开始时将实验动物放置在起始位置处，打开水平通道入口处其中一扇活动门。待实验动物探索完一侧水平通道回到起始位置后，让实验动物在起始位置内滞留5 s，而后将入口处两扇活动门全部打开，当实验动物进入水平通道一侧后，关上另一侧的活动门，待实验动物回到起始区域一次实验结束。重复第二个步骤14次。记录动物每次实验所用时间、每次进入和前一次不同侧通道的比例[15]。

研究者认为此种T型迷宫无奖赏或惩罚因素，动物探索的天性是完成实验的动机，因此能最大限度地减少影响实验结果的混杂因素[16]。但另有研究者发现啮齿动物存在天生的偏侧优势，即动物在T型迷宫中更偏向于向一边走（左边或右边），而且这种现象存在种系差异以及性别差异，各种应激（如饥饿）可以减弱这种偏侧优势。Y型迷宫是一种同T型迷宫类似的检测方法，其实验的设计原理和实验方案和T型迷宫都十分相似，只是把迷宫的形状由T型换成了Y型。

6 Barnes迷宫

1979年Barnes首次采用Barnes迷宫来评定动物的空间记忆能力。Barnes迷宫由一个距离地面50 cm以上的圆形平台构成，平台周边设有10~30个穿透的小洞。平台的直径、厚度以及洞口宽度根据实验动物不同而不同。在平台上方给予强光、噪声以及风吹等刺激，在平台周边选择一个小洞底部放置一个盒子，作为实验动物对刺激的躲避场所；其他洞的底部是空的，试验动物无法进入其中。实验场所放置外形明显的物体作为视觉参照物。动物利用提供的视觉参照物，有效确定躲避场所的洞口所在空间。

实验开始时把实验动物放置在高台中央，记录实验动物找到正确洞口的时间，以及进入错误洞口的次数。每次实验结束后用70%的酒精对洞口进行清洗，变换可以躲避的洞口，但洞口的空间位置不变[17]。相对于其他行为学检测方法而言，Barnes迷宫具有以下几个优点：①不需要食物剥夺或电击，因此对动物的应激较小；②实验对于动物的体力要求很小，能最低限度地减少因年龄因素所致的体力下降对实验结果的影响；③实验所需时间较少。

7 其他

7.1 新事物识别实验

它是基于啮齿类动物具有探索新事物的先天性趋向，探索新事物的过程反映了动物学习、识别和记忆的过程，用来评估动物短记忆的缺损。

7.2 场景性恐惧条件化测试

常用的啮齿类动物情绪性记忆的测试有两种：场景性恐惧条件化（contextual fear condition）与提示性恐惧条件化（cued fear condition）。前者测试的内容是海马依赖型记忆，而后者测试的内容是海马非依赖型记忆。实验分阶段地记录动物僵直不动（freezing）的时间，作为评价结果的依据。

7.3 平衡木测试

用来测试动物的平衡能力和运动能力，小鼠被放在一个长50.8 cm，宽1.2 cm的长木上（悬挂在46 cm高处），两端各有一个14.0 cm×10.2 cm的逃避平台。记录每次实验小鼠掉下长木或到达逃避平台的时间（最长监视60 s，如果小鼠成功到达逃避平台则记录为60 s），三次实验后计算平均时间。

7.4 跳台实验

跳台实验能对动物对新异环境的适应性、探究、紧张、记忆等行为进行评价。在一箱体中，底部铺以铜栅，铜栅通电。箱体底部中央放置一平台（大小和高度根据测试动物而定）。当把动物放在平台上时，会跳下平台并向四周进行探索。如果动物跳下平台时受到电击时会跳回平台以躲避伤害性刺激。记录首次跳下平台的潜伏期、一定时间内受电击的次数（错误次数）。24 h后重复实验1次，记录动物首次跳下平台的潜伏期和一定时间内的错误总数。

AD转基因小鼠模型也表现出类似人类AD患者的各种特征，记忆力下降，反应迟钝，理解力、判断力降低。但对于小鼠这种低等的啮齿类动物，我们只能设计各种行为学实验，通过其行为改变来推测其认知，记忆的改变。目前最常用的是各种各样的迷宫模型，来检测小鼠的空间学习和记忆能力。相信将来会有更多科学的检测方法，用于AD病理模型的研究。

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