Real Time PCR监测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的临床意义

王祥财,廖长风,张庭龙,梁 艳,李海亮,黄 莉,刘礼平,许明君,李树芳

(江西赣南医学院第一附属医院,江西赣州341000;1.血液肿瘤科;2.血液病实验室）

Real Time PCR(CR-T PCR）是近年研制出的一种核酸定量技术,定量范围在0-1013基因拷贝/L,在检测微小残留病灶较其他方法精确、简捷[1],尤其适合于bcr/abl阳性白血病,诊断慢性粒细胞白血病(CML）疗效观察、预后判断等动态监测,我们采用荧光定量Real Time PCR反应技术检测39例CML及其它血液性疾病20例的bcr/abl融合基因表达水平,并对其结果进行探讨分析,现报导如下。

1 材料与方法

1.1 对象

1.1.1 选择2006-2009年我院门诊及住院的慢性粒细胞白血病患者39例,其中男性24例,女性15例,年龄最小16岁,年龄最大 79岁,平均年龄40.6岁,所有病例均按血液病诊断标准[2]明确诊断,其中加速期9例,急变期2例,慢性期28例。

1.1.2 选择同期诊断的各种血液病患者20例作为对照,其中真性红细胞增多症3例,原发性血小板增多症1例,急性粒细胞白血病2例,特发性血小板减少性紫癜5例、缺铁性贫血5例,巨幼细胞性贫血4例。

1.2 方法

1.2.1 提取 取新鲜外周血5 ml或骨髓血2 ml,肝素抗凝,加入等体积生理盐水稀释,经淋巴细胞分离液(Ficoll,相对密度1.077）分离,1 500 r/min离心10 min,取界面层单个核细胞(MNC）,PBS洗涤 1-2次。

采用TRIZOL(Gibco-BRL）一步法提取RNA,紫外线分光光度计测定260-280 nm波长处的吸光度值,并计算RNA含量。-20℃保存。

1.2.2 引物及探针设计、合成bcr/abl融合基因,上游引物(CML-A）:5′-CTTCTCCCTGGCATCCGTGGA-3′;下游引物(CML-B）:5′-TGCAACGAAAAGGTTGGGGT-3′,分别设计在两个基因的exon 2,防止漏检。按照Real Time PCR探针设计要求,CML探针(CML-C）:5′-TTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCC-3′,其中在 5′端标记上荧光发光基团FAM,3′端标记上荧光淬灭基团TAMRA。上述引物及探针均由上海Sangon生物工程公司合成。

1.2.3 cDNA 合成和 Real Time RT-PCR 取2 μ g总RNA进行逆转录反应得到备用cDNA。10倍稀释定量模板制备梯度标准品。测控管与参控管的PCR反应体系为cDNA模板或定量标准品5.0 μ L、PCR反应混合液为 44.0 μ L、Tag 聚合酶 1.0 μ L,反应终体积为50.0 μ L。各反应管置PE5700型Real Time PCR仪中(第一孔为空白对照管或阴性对照）进行扩增。循环参数为:93℃预变性 2 min,然后93℃45 s,55℃55 s共40个循环,最后置33℃保温。反应过程中实时检测扩增过程中的激发荧光强度变化,计算机作出定量结果及定量曲线。最终获得bcr/abl mRNA的拷贝数。

1.3 数据处理采用SPSS14.0英文版软件,将39例患者起始资料录入,建立数据集。对相关指标进行聚类分析及相关性分析。

2 结果

2.1 慢性粒细胞白血病患者实时监控次数2-7次,平均4.1次。

2.2 所有对照组病例检测均为阴性,慢性粒细胞白血病患者39例第一次检测均为阳性,拷贝数3.61×103-7.14×107,平均值5.83×105。

2.3 先对骨髓、血分析等相关指标进行聚类分析,选用系统聚类中的R型聚类方法,聚类参数(类间相似系数）选用最大相似系数法。结果:从聚类的冰柱图可以看出指标共聚成三类,每类包含一组指标。由聚类全过过程中可以直观的看出聚类变化的全过程。根据聚类树形图类间的密切程度,结合医学知识,这些指标分为三类,第一类:包含骨髓嗜碱、外周血嗜碱;第二类:包含粒系总数、骨髓早幼粒、外周血早幼粒;第三类:骨髓原始、外周血原始。

2.4 变量间的相关分析 对39例CML患者“骨髓原始”与“bcr/abl mRNA的拷贝数”之间进行简单线性相关分析,显示两变量之间有一定的相关性,Pearson相关系数r为 0.42,假设检验的P值=0.017＜0.05,差异有统计学意义。对第一类、第二类与bcr/abl mRNA的拷贝数之间差异无统计学意义。

2.5 慢性期病人经口服羟基脲±干扰素治疗,加速期或急变期病人经静脉化疗后,拷贝数均有下降,但未见转阴。慢性期病人经口服羟基脲±干扰素治疗后,拷贝数均有下降,其中6例出现再度上升后进展为加速期或急变期,拷贝数较骨髓检查可提前2-4个月预示。

2.6 经格列卫治疗5例和干细胞移植后1例bcr/abl拷贝数呈明显下降,其中4例至转阴,1例(慢性期转急变期患者）下降后未转阴,又呈上升趋势。

3 讨论

近年来研究证实bcr/abl融合基因,其分子生物学基础是位于9号染色体上的c-abl癌基因与位于22号染色体上的bcr基因形成bcr/abl融合基因。它编码P210等融合蛋白,它的表达,提高了abl基因酪氨酸蛋白激酶的活性,改变了细胞多种蛋白质酪氨酸磷酸化水平和细胞微丝肌动蛋白的功能,从而扰乱了细胞内正常的信号传导途径,使细胞失去了对周围环境的反应性,并抑制了凋亡的发生。Ph染色体是对CML有特殊诊断价值的标志染色体,见于90%-95%的CML病人,还有5%-10%的病例用遗传学方法不能显示其存在,而bcr/abl融合基因的检测阳性率达99%[3],说明分子生物学技术比遗传学方法更敏感,可以从分子水平为部分Ph阴性的CML提供诊断,从而对治疗的选择和预后产生重要影响。

本组检测结果发现,临床诊断CML患者均为阳性,且对照组均为阴性,尽管有报道在某些慢性骨髓增殖性疾病存在一定阳性率(10%-17.6%）[4],但本组试验均未发现阳性结果,认为bcr/abl融合基因是慢性粒细胞性白血病的特异性标志,在诊断中起着决定性作用。

对病人血液及骨髓结果相关指标进行聚类分析,从聚类的冰柱图可以看出指标共聚成三类,第一类:包含骨髓嗜碱、外周血嗜碱;第二类:包含粒系总数、骨髓早幼粒、外周血早幼粒;第三类:骨髓原始、外周血原始。变量间的相关分析,第三类指标与bcr/abl融合基因拷贝数有显著相关性,说明bcr/abl融合基因能直接反映疾病的严重程度及其本质,目前的慢性粒细胞白血病分期也主要依赖于原始细胞和数量。

本组病例中有5例应用格列卫治疗(分别处于慢性期及急变期）和1例经过干细胞移植后患者,其中4例治疗后达到分子学水平缓解,在血液或骨髓中未检出bcr/abl融合基因,但是1例慢性期CML患者应用格列卫后未能下降至阴性,2个月后骨髓细胞学检查亦提示未见缓解,说明CML患者对格列卫治疗反应并不都有效,部分患者不能达到分子学缓解提示预后不良,这时对bcr/abl融合基因进行实时监控尤为重要,能更早提示预后情况,准确判断药物疗效[5]。

由此可见Real Time PCR监测bcr/abl融合基因对明确诊断慢性粒细胞白血病有重要价值,同样是慢性粒细胞白血病治疗和预后观察的决定性指标,有条件的医院值得推广应用,是CML的进一步研究的重要手段。

[1]Van der Velden V H,Hochhaus A,Cazzaniga G,et al.Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real-time quantitative PCR:principles,approaches,and laboratory aspects[J].Leukemia,2003,17:1013.

[2]张之南,沈 悌,主编.血液病诊断及疗效标准[M].第3版.北京科学出版社,2007,134-138,87-91.

[3]Kantarjian HM,Cortes JE,O'Brien S,et al.Long-ter m survival benefit and improved complete cytogenetic andmolecular response rates with imatinib mesylate in Philadephia chromosome positve chronic phase chronic myeloid lekemia after failure of interferonalpha[J].Blood,2004,104(7）:1979.

[4]贺韦东,郭成山.bcr-abl融全基因在骨髓增殖性疾病中的表达及其临床意义[J].临床血液学杂志,2006,19(5）:303.

[5]Emig M,Sausscle S,WittorH,et al.Accurate and rapid analysis of residual in patientswith CML using specific fluorescent hybridization probes for real time quantitative RT-PCR[J].Leukemia,1999,13:1825.