高钙日粮对农安籽鹅不同部位肌肉μ-Calp ain mRNA表达量的影响

王剑 孙会

钙蛋白酶(Calpain)是存在于细胞质中的依赖于Ca2+的中性半胱氨酸内肽酶，主要存在于肌纤维Z盘附近和肌质网膜上。目前已证实哺乳动物体内钙蛋白酶存在13种同工酶，包括7种无组织特异性表达的Calpain1、2、4、5、7、10和12；6种组织特异性表达的Calpain3、6、8、9、11和13[1]，其中有关Calpain1和Calpain2的研究最为深入。Calpain1和Calpain2两种异构体根据钙蛋白酶表现半最高活性所需的Ca2+浓度的不同又称为μ-Calpain和m-Calpain。其中μ-Calpain所需的Ca2+为1～12 μmol/l，而m-Calpain则需要250～750 μmol/l[2]。由于m-Calpain需要较高浓度Ca2+激活，而宰后肌肉中Ca2+浓度很难达到，所以在肌肉嫩化过程中μ-Calpain参加反应并对肌肉嫩度有改善作用，是肌肉蛋白降解的重要酶类。近些年μ-Calpain基因作为肉品质的候选基因在猪、牛、羊的研究中已经有所报道，而关于家禽类动物的研究报道并不多。本试验主要研究高钙日粮对鹅不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表达量的影响，从而确定在日粮中添加钙的适宜剂量以改善鹅肉品质。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选用体重近似、性别一致、健康状况良好的8周龄农安籽鹅120只。预饲期7 d，试验期28 d。

1.2 试验设计

本试验采用2因素4水平的试验设计方法。设4个处理组，对照组饲喂基础日粮(Ca 0.6%)，试验1组(Ca 0.9%)，试验2组(Ca 1.2%)，试验3组(Ca 1.5%)。钙源均采用丙酸钙。每个处理3个重复，每个重复10只鹅。

1.3 日粮配制（见表1）

表1 日粮组成及营养水平

采用玉米-豆粕型日粮，日粮参照美国NRC(1994版)禽的营养需要进行设计，并采用粉料形式进行配制。

1.4 饲养管理

在试验期内，采用地面分圈散养。每日饲喂三次(早8:00，中午11:30，晚4:30)，每次喂料量以吃饱后略有剩余为准，记录采食量，自由饮水。

1.5 样本采集及各组织总RNA的提取

本试验分别于7、14、21、28 d进行屠宰，取胸肌、腿肌大约100 mg置于冻存管内在液氮罐中暂存，之后转入-80℃冰箱中保存。分别取4组鹅胸肌和腿肌肉各50 mg，按RNA抽提试剂盒的使用说明分别提取胸肌和腿肌的总RNA。利用核酸蛋白仪和琼脂糖电泳测定RNA浓度和纯度，RNA浓度要求在A260/A280 1.8～2.0之间可以使用，提取的总RNA置于-80℃冰箱中保存。

1.6 引物的设计与合成

μ-Calpain基因与β-actin基因序列从GenBank中检索获得,基因号分别为NM_205303和L08165。用primer软件设计，探针（Probe）5'CAATGGCTCCGGTATGTGCAAGGC3'，其中5'端标记FAM，3'端标记TEMRA，引物与探针由北京华大基因工程公司合成。其引物序列见表2。

表2 基因的引物的序列和扩增大小

1.7 实时荧光定量PCR

反应参照TOYOBO公司ReverTra Ace Qpcr RT Kit试剂盒进行，取肌肉组织中的总RNA 2 μl、RT Buffer 4 μl、RT Enzyme Mix 1μl、Primer Mix 1 μl，其余试剂按试剂盒要求加入PCR管中，反应体系为20μl，反应程序为：37℃15 min、98℃5 min。反应产物置于-20℃冰箱保存。RT反应结束后进行PCR反应，将RT反应的产物应用为PCR模板。实时荧光定量PCR方法参照实时荧光定量MaximaProbe/ROX qPCR Master Mix，使用ABI step one_plus Real-time RCR System进行实时荧光定量PCR，PCR扩增反应的反应体系为25 μl。PCR反应程序为：95℃预变性10 s、95℃变性5 s、45.5℃退火20 s、72℃延伸30 s，40个循环。反应后产物做琼脂糖凝胶电泳检测。

1.8 统计分析

试验数据采用SPSS（16.0）软件进行双因素方差分析，用Duncan's法多重比较分析组间差异显著。试验数据均用平均值±标准差(Mean±SD)表示。

2 结果与分析

2.1 样本总RNA提取结果(见图1)

组织提取的总RNA经紫外分光光度计检测，A260/A280在1.8～2.0之间，由图1可知，RNA分子条带清晰、完整性好、RNA降解低、无DNA污染，能满足试验要求。

图1 样本总RNA琼脂糖凝胶电泳图

2.2 建立标准曲线

以不同拷贝数标准品重组质粒模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中出现荧光信号的初始循环数(Ct)为纵坐标，分别作出β-actin基因与μ-Calpain基因的标准曲线。

β-actin基因标准曲线在模板浓度梯度为10-3～10-10的范围内构建，β-actin基因标准曲线方程Y=-3.233x+36.931，回归系数0.995，扩增效率103.841。其中Y为Ct值，X为模板量的对数值。标准曲线的扩增效率在理想的90%～105%的范围内，试验重复性好（见图2）。

μ-Calpain基因标准曲线在模板浓度梯度为10-3～10-10的范围内构建，μ-Calpain基因标准曲线方程Y=-3.265 3x+31.343，回归系数0.986，扩增效率102.204。其中Y为Ct值，X为模板量的对数值。标准曲线的扩增效率在理想的90%～105%的范围内，试验重复性好(见图3)。

图2 β-actin基因标准曲线

图3 μ-Calpain基因标准曲线

2.3 目的基因RT-PCR扩增曲线

组织Total RNA经过反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增反应，反应后系统根据荧光值的变化规律，自动生成反应循环数与荧光量变化的扩增反应动力学曲线(见图4)。

图4 μ-Calpain mRNA荧光定量PCR循环数与荧光强度的关系曲线

2.4 高钙日粮对鹅不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表达量的影响（见表3）

由表3可知，高钙日粮对鹅胸肌和腿肌μ-Calpain mRNA表达量无显著影响(P＞0.05)，在不同钙水平下，胸肌μ-Calpain mRNA表达量高于腿肌μ-Calpain mRNA表达量。

表3 高钙日粮对鹅不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表达量的影响

2.5 不同屠宰时间对鹅不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表达量的影响（见表4）

表4 不同屠宰时间对μ-Calpain mRNA表达量的影响

由表4可知，不同屠宰时间对胸肌μ-Calpain mRNA表达量影响极显著，且在屠宰第21 d与屠宰第7、14、28 d之间差异极显著(P＜0.01)，第7、14、28 d之间差异不显著。胸肌的μ-Calpain mRNA表达量均高于腿肌μ-Calpain mRNA表达量。

3 讨论

3.1 高钙日粮对鹅不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表达量的影响

本试验结果表明，添加不同钙水平日粮对鹅胸肌和腿肌μ-Calpain mRNA表达量无显著影响(P＞0.05)。其原因可能是随着钙水平的提高，机体中吸收Ca2+含量也逐渐增加，然而机体中Ca2+的吸收存在一定的阈值，通过体内代谢与相关激素的调节，使得钙含量保持动态的平衡。当机体钙摄入量不超过这一阈值时，机体钙含量相对增加，从而提高了肌肉μ-Calpain mRNA表达量。但当机体摄入钙过多的时候，吸收机制受到阻碍，过多的钙随着粪便与尿一同排出体外。另外也有可能在高钙日粮条件下，吸收较多的Ca2+也有可能激活了Calpastatin，从而抑制了μ-Calpain的活性，即μ-Calpain mRNA表达量无显著变化。在不同钙水平日粮条件下，胸肌μ-Calpain mRNA表达量高于腿肌μ-Calpain mRNA表达量。这与刘安芳[3]研究结果相一致。刘安芳在鸡不同组织中测定钙蛋白酶表达量的试验结果表明，胸肌μ-Calpain mRNA的表达量显著高于腿肌的表达量。与肖蔹[4]的研究结果相似，在前42 d测定山地乌骨鸡不同组织μ-Calpain表达量的结果显示，胸肌的表达量高于腿肌的表达量。其可能的原因是由于随着钙水平的提高，大量Ca2+的摄入造成胸肌中Ca2+的沉积量要大于腿部肌肉Ca2+的沉积量，造成了从整体上来看胸肌表达量高于腿肌的表达量。

3.2 不同屠宰时间对鹅不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表达量影响

本试验研究结果表明，第21 d屠宰的胸肌μ-Calpain mRNA表达量与第7、14、28 d屠宰之间差异极显著(P＜0.01)，而第7、14、28 d屠宰的胸肌μ-Calpain mRNA表达量无显著差异(P＞0.05)。不同屠宰时间对腿肌μ-Calpain mRNA表达量无显著影响(P＞0.05)。这可能因为不同的饲喂时间，机体吸收的Ca2+在胸肌沉积量有所不同，导致对μ-Calpain mRNA表达量影响不同，而腿肌沉积的Ca2+量无明显差异，因此对μ-Calpain mRNA表达量无显著影响。

本试验结果显示，鹅不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表达量是不同的，即胸肌μ-Calpain mRNA表达量均高于腿肌，以第21 d屠宰胸肌与腿肌的差距最大。这可能是由于机体吸收的Ca2+在不同部位肌肉沉积量是不同的，因而刺激μ-Calpain活性的大小不同，即不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表达量不同，胸肌μ-Calpain mRNA表达量高于腿肌。

4 结论

添加不同水平丙酸钙的日粮对鹅胸肌和腿肌μ-Calpain mRNA表达量无显著影响。在添加0.9%Ca2+时，胸肌μ-Calpain mRNA表达量达到比较高的水平，1.2%Ca2+对腿肌μ-Calpain mRNA表达量影响较大；而以第14 d屠宰对鹅腿肌μ-Calpain mRNA表达量影响最大，第21 d屠宰对鹅胸肌μ-Calpain mRNA表达量影响最大。

[1] Sorimachi H,Ono Y.Physiological function of calpains[J].Biochemistry，1997，328:721-732.

[2] Sorimachi H,Kinbara K,Kimura S,et al.Muscle-specific Calpain,p94,responsible for limb girdle muscular dystrophy type 2A associates with connection through IS2,a p94 specific sequence[J].Journal of Biological Chemistry,1995,270:31158-31162.

[3] 刘安芳，朱庆，刘益平，等.钙蛋白酶基因在鸡不同组织和品种中的表达差异[J].中国畜牧杂志，2007，43（19）:4-7.

[4] 肖蔹，张增荣，黄毅，等.山地乌骨鸡不同组织中CAPN 1基因表达的发育性变化[J].四川畜牧兽医，2010，5（03）:34-37.