Survivin、Bax蛋白在喉病变组织中的表达及临床意义

蔡 雯,崔 颖,张婷婷,张 本

(1.辽宁医学院耳鼻咽喉-头颈外科专业研究生班,辽宁锦州 121001;

2.辽宁医学院附属第一医院耳鼻咽喉-头颈外科,辽宁锦州 121001）

喉癌(1aryngeal neop lasms)是耳鼻咽喉科常见的恶性肿瘤,严重威胁人类的健康,发病率仅次于鼻咽癌,国内各地统计喉癌约占耳鼻咽喉科恶性肿瘤发病率的7.9%～35%,占全身恶性肿瘤的1.2%～1.6%[1]。喉癌的早期发现对于喉癌的预防及早期治疗有着重要意义。东北地区是喉癌的高发地区,喉癌的发病率明显高于其他省市。近年来对于凋亡抑制蛋白(Survivin)及凋亡促进蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)在恶性肿瘤中的表达已经成为研究重点,但目前对于Survivin与Bax在声带息肉、喉不典型增生与声门区喉癌中的表达关系与临床意义的研究较少。本文探讨这两种蛋白在3种病变的表达对于较早的诊断与预防喉癌具有重要的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择本院2000至2010年诊治的声带息肉、喉不典型增生、声门区喉癌手术标本各24例。其中男54例,女18例。平均年龄60.06岁。喉不典型增生中包括:声带白斑与喉乳头状瘤。喉癌病理证实均为声门区喉鳞状细胞癌,术前均未做过放疗及化疗。按国际抗癌协会(UICC)标准(2002)确定TNM分期。Ⅰ期 8例,Ⅱ期3例,Ⅲ期 13例,Ⅳ期0例。

1.2 免疫组化检测方法 第一抗体Bax和Survivin多克隆抗体以及SP免疫组化试剂盒均为上海蓝基公司产品,第一抗体工作液浓度Bax和 Survivin均为1∶200。每次染色均用磷酸盐缓冲液(PBS)替代第一抗体作阴性对照。所有标本均经10%中性甲醛固定,常规石蜡病理切片,脱蜡水化。用微波3 m in进行抗原修复,PBS漂洗4m in,共3次,置入3%H2O210 m in,PBS漂洗4m in,共3次,正常血清37℃孵育10m in,加入一抗工作液4℃冰箱孵育过夜,再用PBS漂洗 4m in,共3次,加入生物素标记二抗37℃孵育30m in,PBS漂洗4 m in,共3次,再加入辣根酶标记链霉素卵白素工作液37℃孵育30m in,PBS漂洗 4m in,共3次。DAB显色,苏木精复染细胞核,中性树胶封片,显微镜观察照相。

1.3 染色结果判断 阳性显色为棕黄色,Bax蛋白只在胞质着色;Survivin蛋白表达以胞质着色为主,偶见胞核表达。高倍镜下每张切片选择5个视野进行计数,取平均值,阳性细胞大于10%为阳性。

1.4 统计学处理 两样本率的比较采用四格表资料的χ2检验及相关分析。

2 结 果

2.1 不同病变喉组织中Bax蛋白的阳性表达水平 按声带息肉、喉不典型增生、声门区喉癌逐渐降低(图1～3)。而Survivin蛋白则逐渐增高(图4～6)。

图1 Bax蛋白在声带息肉中的阳性表达(SP,×400)

图2 Bax蛋白在喉不典型增生中的阳性表达(SP,×400)

图3 Bax蛋白在声门区喉癌中的阳性表达(SP,×400)

2.2 3组间Bax与Survivin的表达情况比较 Bax在声带息肉组的阳性率为87.50%,与喉不典型增生组的阳性率54.17%比较差异有统计学意义(P＜0.05)。喉不典型增生组的阳性率与声门区喉癌组的阳性率41.67%比较差异无统计学意义(P＞0.05)。而喉癌组的阳性率与声带息肉组比较差异有统计学意义(P＜0.05),见表1。Survivin在声带息肉组的阳性率为25.00%,与喉不典型增生组的阳性率58.33%比较差异有统计学意义(P＜0.05)。喉不典型增生组的阳性率与喉癌组的阳性率 70.83%比较差异无统计学意义(P＞0.05)。喉癌组的阳性率与声带息肉组比较差异有统计学意义(P＜0.05),见表 2。

图4 Survivin蛋白在声带息肉中的阳性表达(SP,×400)

图5 Survivin蛋白在喉不典型增生中的阳性表达(SP,×400)

图6 Survivin蛋白在声门区喉癌中的阳性表达(SP,×400)

表1 Bax在不同组织中表达情况比较

2.3 Bax的阳性表达水平与声门区喉癌组织的分级呈负相关Ⅰ、Ⅱ级鳞状细胞癌呈高表达,Ⅲ级鳞状细胞癌呈低表达。与性别、年龄无关。Survivin蛋白的表达水平与喉鳞状细胞癌的分级呈正相关。Ⅰ、Ⅱ级鳞状细胞癌呈低表达,Ⅲ级鳞状细胞癌呈高表达。与性别、年龄无关,见表3。

2.4 Bax蛋白在喉癌的表达与Survivin蛋白表达之间的关系24例喉癌患者中17例Survivin蛋白呈阳性表达,阳性表达率为70.83%。从表4中可以看出:在Survivin蛋白表达阳性、阴性标本中,Bax蛋白阳性率分别为23.53%(4/17)、85.71%(6/7)。二者在喉癌中有着负相关的作用(r=-0.201 4,P＜0.05)。

表2 Survivin蛋白在不同组织中表达情况比较

表3 Bax蛋白和Survivin蛋白与声门区喉癌组织学分级的关系[n(%)]

表4 24例喉癌患者中Bax蛋白与Survivin蛋白的表达关系

3 讨 论

细胞凋亡是在生理或病理条件下由基因控制的自主有序的程序性死亡过程。凋亡抑制可以使细胞躲过死亡而异常增殖,导致肿瘤发生、发展[2]。细胞凋亡一直是医学界关注的焦点,它在肿瘤的发生和发展中起着不容忽视的作用。

凋亡抑制基因 Survivin是近年来发现的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)家族的新成员,位于17q25,全长为15 kb,有 4个外显子和3个内含子,Survivin基因编码产生一个由142个氨基酸组成的分子量16.5 KD的胞浆蛋白。Survivin在胚胎和发育的胎儿组织中表达丰富,而在正常终末分化的成人组织中不表达,在大多数人类肿瘤组织中又存在Survivin mRNA和蛋白的表达,其表达与多种肿瘤的生物学特性和疾病分期有关[3-5]。本研究中Survivin在息肉组织中低表达,表明此蛋白在良性病变中也有一定的表达。Sur-vivin主要通过直接作用于Caspase-3、Caspase-7,抑制其活性而发挥抗凋亡作用[6]。还可以通过与细胞周期G2/M有丝分裂纺锤体的微管蛋白特异性结合,以维持有丝分裂的方式发挥抗凋亡作用[7]。本研究检测喉良性病变、喉不典型增生、声门区喉癌各24例组织中,在喉良性病变中表达明显低于喉癌与喉不典型增生,差异有统计学意义。表明Survivin在喉细胞癌变的过程中起到明显的促进作用。并且Survivin在喉癌中的阳性表达率为70.83%,与 Dong等[8]首次报道了 Survivin在喉癌中的表达情况相近,其Survivin表达率为65.7%。统计显示,Survivin在不同临床分期的喉癌组织中也存在显着性差异,提示Survivin对于喉癌的发展也起到促进作用,与相关文献[9]报道的Survivin参与癌症的发展相一致,可结合临床作为肿瘤分期与预后的参考指标。Survivin在年龄与性别的表达上差异无统计学意义。

Bax基因为Bcl-2基因家族一员,Bcl-2基因是一种原癌基因,具有抑制凋亡的作用,最早由Tsujimot等[10]于 1984年在大多数非霍奇金滤泡状B细胞淋巴瘤中首先发现。人Bax基因是Oitvai等[11]在1993年首先在白细胞介素-3(IL-3)依赖的细胞凋亡过程中发现的。Bax位于染色体19q13上,含6个外显子,其编码的蛋白分子量为21 KD,与Bcl-1蛋白具有21%的同源性,是细胞凋亡的促进因子[12]。当Bax蛋白大量表达,通过其自身形成Bax同二聚体和/或与Bcl-2形成Bax-Bcl-2异二聚体,抑制 Bcl-2功能,加速细胞死亡,Bcl-2和Bax的表达程度与二者的比例(Bax/Bcl-2)[13]对于决定细胞接受凋亡信号后存活与否起关键作用。本实验检测喉良性病变、喉不典型增生、声门区喉癌各24例组织中,在声带息肉组中明显高于喉不典型增生组与喉癌组,差异有统计学意义。表明Bax对于喉细胞癌变的过程中起着抑制作用。统计显示,Bax在临床分期Ⅰ～Ⅱ级的表达中明显高于Ⅲ～Ⅳ级的表达,提示Bax对于喉癌的发展也起到抑制其发展的作用。Bax在年龄与性别的表达上差异无统计学意义。

以往研究中多是由Survivin与Caspase或Bax与Bcl-2这两组一对一配对组合的蛋白在喉癌的发生发展中的作用。而Survivin 是可中和由 IL-3、Fas、Bax、TNF-α、Caspase、抗癌药物X-射线所诱导的凋亡刺激物[14-15]。因此,本实验将参与两种不同凋亡途径的Survivin与Bax蛋白在喉病变组织的表达情况与联系进行分析,结果这两种蛋白也都参与了喉组织由良性病变至恶性病变的发展过程,在肿瘤的发生、发展过程中的作用不同,并有着负相关的抑制与促进凋亡的作用,表明在喉组织病变发生、发展的过程中这两种凋亡途径都起着作用并有着相互的影响。本实验打破了以往将声带息肉作为阴性对照组的比较,将声带息肉、喉不典型增生、声门区喉癌 3种疾病进行了比较。通过本实验可以初步了解到Survivin与Bax在喉良性病变、喉不典型增生、声门区喉癌3种组织中有着明显的递增与递减的关系,并在喉癌组织中有着负相关性的表达。由此可见,两者对于喉癌的发生、发展起着负相关的作用。在临床应用中提供一个辅助参考指标,为较早诊断与预防喉癌的发生提供理论依据。

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