大豆分离蛋白酶解产物功能特性的研究*

陈 靓，朱秀清,2**，窦巍巍，夏明敬，王 玲

（1.东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030；2.国家大豆工程技术研究中心，哈尔滨 150030）

大豆分离蛋白（soybean protein isolated,SPI）是利用高科技从脱脂大豆中除去大豆纤维和水溶性的非蛋白部分后所得[1]，它不仅以其营养价值高、资源丰富、成本低而倍受青睐，更为重要的是大豆蛋白还具有与食品的嗜好性、加工性等相关的各种功能特性，包括乳化性、起泡性、保水性、凝胶性等多种功能特性[2]。因此大豆蛋白被广泛应用于饮料、焙烤食品、乳品、蛋白替代品、肉制品等食品工业领域。然而，大豆分离蛋白在现代食品加工中的应用受到一定的限制，这是因为其本身的功能性质还不能完全满足现代食品加工的需求，不同食品的加工对大豆分离蛋白功能性质的要求不同，部分功能性需要加强或减弱。因此，对大豆分离蛋白的改性，提高大豆制品营养成分的生物有效利用性成为食品加工工业亟待解决的问题。

酶法改性是一种常用的改性方法，酶水解程度不同导致大豆分离蛋白结构等方面的改变也不同，通过酶改性可得到满足不同需求的功能性大豆分离蛋白质，从而拓宽大豆蛋白在食品工业中应用的范围[3]。目前，国内外学者在大豆分离蛋白的改性研究方面做了许多工作。研究证明适当的酶解大豆分离蛋白可以提高大豆分离蛋白的溶解性、乳化性、乳化稳定性和起泡能力[4,5]。但目前对酶解后大豆分离蛋白各种功能性质变化趋势的研究，报道较少。本研究分别使用了木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶对大豆分离蛋白进行水解，并对大豆分离蛋白各个时间段的酶解产物功能性质的变化趋势进行了比较，为加工不同功能性大豆分离蛋白提供理论参考和支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大豆分离蛋白（干基蛋白质含量85.58%，水分含量6.65%）：哈高科大豆食品有限公司；碱性蛋白酶（酶活力为1.7×105U/mL）：Novo公司；木瓜蛋白酶（酶活力为5.4×104U/g）：广西南宁杰沃利生物制品有限公司；福林酚、SDS：Sigma公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠：天津市东丽区天大化学试剂厂；无水硫酸钠：天津市科密欧化学试剂有限公司；甘油：天津市津东天正精细化学试剂厂。

1.2 主要仪器与设备

LD4-2A低速离心机：北京医药离心机制造厂；Z36HK高速离心机：Hermle Labortechlk GmbH；B-290喷粉机：瑞士BÜCH公司；TA-XT2i型物性仪：英国 Stable Micro System公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；HZS-H水浴振荡器：哈尔滨东联电子技术开发有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 大豆分离蛋白酶解产物的制备

（1）工艺流程

（2）酶解条件 选用两种酶进行酶解，按照各种酶研究的基本使用条件进行[6]，优化的酶解条件见表1。大豆分离蛋白酶解液水解度的测定应用甲醛滴定法测定[7]。

表1 大豆分离蛋白酶的酶解条件

1.3.2 大豆分离蛋白酶水解物加工性能的测定

（1）溶解性 2.00g固体样品加入40mL蒸馏水，调节pH至7.0，搅拌30min后离心（10000r/min，15min），测定上清液中的氮含量，重复试验3次，结果以氮溶解指数（NSI）表示，以平均数表示测定结果。

（2）保水性 5.00g固体样品中加入30mL蒸馏水，搅拌均匀后室温放置30min，然后离心（4500r/min，30min）分离出上清液，测定残留物质量，同时测定上清液中的氮含量转换为蛋白质质量，重复试验3次[8]。

（3）吸油性 3.00g固体样品中加入大豆油9mL，搅拌均匀后室温放置30min，使之充分吸油，然后离心（7500r/min，30min），除去液体后，测定残留物的重量，重复试验3次[9]。

（4）乳化性 0.2mol/L、pH 7.0的磷酸缓冲溶液配制1%的固样溶液与大豆油加入比例为4：1，最高转速下（10000rpm）均质1min，然后分别在0min和10min从烧杯底部吸取200uL乳状液，用10mL 0.1%SDS（十二烷基硫酸钠）溶液稀释。在500nm条件下，以0.1%的SDS为空白样，测定吸光值，重复试验3次[10]。

（5）发泡性 将5%的样品溶液200mL置于实验室自制的组织捣碎机中，最高转速下（10000r/min）搅拌1min，然后分别在0min和10min时读取数据，待消泡后重复上述过程，共3次。

式中，H10—搅拌后放置10min泡沫的高度。

（6）凝胶性

a 凝胶的制备 取4g固样配制成20%的样品溶液，磁力搅拌均匀并离心（2500r/min，15min），密封后至于90摄氏度的水浴中加热30min，然后转移到冰浴中冷却20min至室温，样品在冰箱中（4℃）贮存24h。

b 凝胶硬度的测定 使用TA-XT2i型物性测试仪测定凝胶硬度，探头为P 0.5圆柱平头状探头，测试前速度为2mm/s，测中速度为5mm/s，测试后速度为2mm/s，压缩深度为15mm，硬度定义为凝胶强度，单位g。

（7）粘度 取4.5g固样配制成15%的样品溶液60mL，磁力搅拌均匀，用旋转粘度仪测定其粘度，测定3次。

（8）成膜性 制膜→测定膜厚度→回软揭膜→测定抗拉强度[11]

2 结果与讨论

2.1 大豆分离蛋白酶水解产物变化规律

图1 酶解时间对大豆分离蛋白酶水解程度的影响

由图1可知，大豆分离蛋白随着酶解时间的增加，水解度也随之升高。相同酶解时间碱性蛋白酶水解产物的水解度比木瓜蛋白酶水解产物的水解度高，反应8h碱性蛋白酶水解产物的水解度可达20.66%，木瓜蛋白酶水解产物的水解度可达9.81%。由于碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶在反应1h前水解度均迅速升高；两种酶解产物7h和8h的水解度较6h无明显变化，所以研究中确定酶解时间为20min、40min、1h、2h、4h、6h。

2.2 大豆分离蛋白酶解产物功能性研究

2.2.1 溶解性

图2 酶解时间对大豆分离蛋白酶解产物溶解性的影响

由图2可知，溶解性用氮溶指数NSI表示，大豆分离蛋白碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解产物的NSI值随酶解时间的增加呈上升趋势，且均高于大豆分离蛋白本身，但相同时间木瓜蛋白酶水解产物的溶解性较碱性蛋白酶的高。大豆分离蛋白的NSI值为72.24%，碱性蛋白酶水解产物NSI值最高为88.67%，木瓜蛋白酶水解产物NSI值最高为83.93%。这是因为大豆分离蛋白酶解后，断裂成多肽和小分子短链物质，使-NH2和-COOH的数目增多，极性增加，电荷密度增大，亲水性增强，从而提高了溶解性，表现为NSI值增高。同时由于被11S酸性亚基紧紧包裹着的碱性亚基结构疏水性很强且致密，难以被酶解，所以水解速度缓慢，表现为随着水解度的升高[12]，水解度与NSI值即溶解性的关系偏离线性[13,14]。

2.2.2 保水性

图3 酶解时间对大豆分离蛋白酶解产物保水性的影响

由图3可知，随着酶解时间的增加，大豆分离蛋白碱性蛋白酶水解产物的保水性明显下降；而木瓜蛋白酶水解产物的保水性在酶解4h前明显高于大豆分离蛋白本身，且在1h时其保水性达到最高。大豆分离蛋白的保水性为5.56g/g；从20min至6h碱性蛋白酶水解产物保水性从4.55g/g逐渐下降至3.37g/g；木瓜蛋白酶水解产物保水性最高可达6.05g/g。这是由于大豆分离蛋白被酶解后，大量的亲水基团外露，使保水性有所提高[15]。又由于酶解程度的增加，水解度进一步增大，形成了更多的小分子，不利于形成蛋白质的网状结构且氢键减少而导致保水性降低[16]，同时蛋白质发生变性或聚集作用也可引起保水性下降。碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白的速度较快，所以其水解物的保水性在20min时已经低于大豆分离蛋白。同时由于木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白的作用位点Lys和Asp残基可以结合6分子水，所以表现为木瓜蛋白酶水解产物的保水性优于碱性蛋白酶水解产物。

2.2.3 乳化性

（1）碱性蛋白酶 由图4可知，大豆分离蛋白碱性蛋白酶酶解产物的乳化活性及乳化稳定性随着反应时间的增加逐渐降低，且一直低于大豆分离蛋白原料。大豆分离蛋白的乳化活性为7.45mL/g，乳化稳定性为14.49min；大豆分离蛋白碱性蛋白酶酶解物在20min时乳化活性为7.73mL/g，乳化稳定性为13.87min。

图4 酶解时间对大豆分离蛋白碱性蛋白酶水解产物的乳化活性及乳化稳定性的影响

（2）木瓜蛋白酶

图5 酶解时间对大豆分离蛋白木瓜蛋白酶水解产物的乳化活性及乳化稳定性的影响

由图5可知，大豆分离蛋白木瓜蛋白酶水解产物的乳化活性和乳化稳定性是先升高后降低，且一直高于大豆分离蛋白原料。大豆分离蛋白的乳化活性为7.45mL/g，乳化稳定性为14.49min；大豆分离蛋白木瓜蛋白酶的水解产物在反应2h时乳化活性达到最高为8.44mL/g，乳化稳定性在反应1h时达到最高为18.18min。

这是因为随着酶解的进行，7S和11S分子断裂成许多肽段，疏水基被暴露，使大量肽分子进入油水界面，降低了界面张力，疏水基向里亲水基向外包裹在油表面，起到了保护作用，同时由于-COO-所带的电荷，通过静电排斥作用阻止了油滴间聚和，提高了乳化能力。一般认为蛋白质

的疏水性越大，界面上吸附的蛋白质浓度越大，界面张力越小，乳浊液因而也就更稳定。随着水解度的增大，对维持蛋白质稳定结构的氢键、范德华力、离子键等键破坏程度也越来越大，包裹在油滴表面的肽段越来越小，使油滴表面的保护层越来越薄，最终导致了乳化性的降低，也导致了乳化稳定性的降低[17]。而大豆分离蛋白碱性蛋白酶水解产物乳化活性和乳化稳定性随着酶解时间的增加均不断下降，这是由于碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶的酶解速度和剪切位点不同，使得碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白20min时乳化活性和乳化稳定性已经低于大豆分离蛋白。

2.2.4 吸油性

图6 酶解时间对大豆分离蛋白酶解产物吸油性的影响

由图6可知，大豆分离蛋白在碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解前期吸油率都略有升高，之后缓慢降低趋于平缓。大豆分离蛋白本身的吸油率为0.99g/g，大豆分离蛋白碱性蛋白酶水解产物在20min时达到最大值1.03g/g，木瓜蛋白酶水解产物在40min时达到最大值1.13g/g。这是因为吸油性是油与疏水性基团结合，将油包裹在大豆分离蛋白中，在水解度较低时，蛋白质侧链上的疏水基团进一步外露，致使吸油率升高。随着水解度的增加，肽链不断变小，形成包裹油的网络结构被破坏造成吸油率降低。

2.2.5 发泡性

图7 酶解时间对大豆分离蛋白碱性蛋白酶水解产物发泡能力及发泡稳定性的影响

（1）碱性蛋白酶 由图7可知，随着酶解时间的增加，大豆分离蛋白碱性蛋白酶水解产物的发泡膨胀率先升高后降低，且普遍高于大豆分离蛋白本身；而其发泡稳定性逐渐下降，且普遍低于大豆分离蛋白。大豆分离蛋白的发泡膨胀率为83.33%，发泡稳定性为47.53%；大豆分离蛋白碱性蛋白酶酶解产物在40min时发泡膨胀率最大为145.33%；而其发泡稳定性随着反应时间的进行，由36.24%降至24.58%。

（2）木瓜蛋白酶

图8 酶解时间对大豆分离蛋白木瓜蛋白酶水解产物发泡能力及发泡稳定性的影响

由图8可知，随着酶解时间的增加，大豆分离蛋白木瓜蛋白酶水解产物的发泡膨胀率先升高后降低，且普遍高于大豆分离蛋白本身；而发泡稳定性逐渐下降，且普遍低于大豆分离蛋白。大豆分离蛋白的发泡膨胀率为83.33%，发泡稳定性为47.53%；大豆分离蛋白木瓜蛋白酶酶解产物在2h时发泡膨胀率最大为177.50%；其发泡稳定性随着反应时间的进行，由31.13%降至27.01%。

这是因为酶解可大幅度提高蛋白质溶液的发泡能力，从分子角度上讲，形成液泡需要蛋白分子的肽链展开，在液面上通过各种相互作用形成一种坚韧的液膜，而酶解正好起到了这一作用，并且通过提高溶解度，使更多的肽参与进液膜的形成，从而提高了发泡能力；但是随着酶解的进行，肽链越来越短，使液膜越来越弱，即泡沫稳定性越来越差，最终导致了发泡能力的减弱。表现在粘度上，刚开始粘度的减小有利于泡沫的形成[18]，但当粘度较小时，液膜非常脆弱，无法裹住气泡，泡沫稳定性变得非常差，从而不利于泡沫的形成。另外随着酶解的进行，蛋白质分子的电荷增加，由于静电作用阻止蛋白质分子在气液表面的吸附作用加强，也降低了发泡稳定性。大豆分离蛋白木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶水解物发泡膨胀率变化趋势不同，这是因为两种酶的作用位点和相同酶解时间的水解度不同造成的。

2.2.6 粘度

图9 酶解时间对大豆分离蛋白酶解产物粘度的影响

由图9可知，木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶水解后的大豆分离蛋白的粘度均呈下降趋势。大豆分离蛋白碱性蛋白酶水解产物在1～2h之间下降速度较快，由4216MPa·s降至1463MPa·s；木瓜蛋白酶水解产物则在40min至1h下降较快，由5728MPa·s降至4900MPa·s。大豆分离蛋白原料粘度为68014MPa·s，远远大于大豆分离蛋白酶碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解产物。这是由于随着大豆分离蛋白酶解的进行，小分子肽类增多，网状结构破坏，膨胀率降低，蛋白多聚体的解离和离子基团的增加，使蛋白质分子的有序性增加，蛋白质的表观体积减少，而使粘度下降。由于碱性蛋白酶水解产物的水解度比木瓜蛋白酶的高，所以相同时间大豆分离蛋白碱性蛋白酶水解产物比大豆分离蛋白酶木瓜蛋白酶水解产物的粘度要小。

2.2.7 凝胶性

表2 酶解时间对大豆分离蛋白酶解产物凝胶性的影响

由表2可知，大豆分离蛋白有良好的凝胶性，随着酶解时间的增加大豆分离蛋白的凝胶性不断下降，其中大豆分离蛋白碱性蛋白酶水解产物的变化程度更大，酶解1h后不成凝胶。这是因为在酶解过程中，大豆球蛋白被酶解成小的肽链，同时二硫键和氢键等分子间的作用力受到破坏，使得蛋白质分子之间很难形成稳定的网络结构，不利于形成凝胶，所以酶解程度增大，凝胶强度降低[19]。碱性蛋白酶，水解位点不同于木瓜蛋白酶，并且水解速度较快，使得大豆分离蛋白碱性蛋白酶水解产物的凝胶程度下降很快，几乎不能成胶；而木瓜蛋白酶水解速度较慢，所以使木瓜蛋白酶水解产物相对于碱性蛋白酶水解产物凝胶程度下降的慢。

2.2.8 成膜性 由试验可知，大豆分离蛋白可以形成薄膜，其厚度为0.21cm，牵拉强度为62.204N。而经过酶水解后的大豆分离蛋白均不能成膜。这是由于成膜性是加热和碱处理导致大豆分离蛋白变性，使大豆分离蛋白中7S和11S球蛋白四级结构破坏，亚基中多肽链展开拉伸成链状，发生交联而成膜。蛋白质长链聚合结构对薄膜的性质很重要，蛋白质交联度越高，膜的拉伸强度越强。另外，大豆蛋白成膜机理与蛋白质凝胶性有关，即蛋白质受热后聚合形成较大分子的凝胶体[20]，分子间聚合通过氢键、二硫键以及其他化学键联结而成。而经酶解后，大豆蛋白被酶解成小的肽段，链长变短，并且破坏了分子间的氢键、二硫键等化学键，致使分子间网络结构难以形成，导致成膜失败。

3 结论

（1）随着酶解时间的增加，大豆分离蛋白碱性蛋白酶水解产物的水解度、溶解性逐渐升高，吸油性、发泡能力先升高后下降，保水性、乳化活性及乳化稳定性、发泡稳定性、粘度、凝胶性逐渐下降。

（2）随着酶解时间的增加，大豆分离蛋白木瓜蛋白酶水解产物的水解度、溶解性逐渐升高，保水性、吸油性、乳化活性及乳化稳定性、发泡能力先升高后下降，发泡稳定性、粘度、凝胶性逐渐下降。

（3）随着酶解时间的增加，大豆分离蛋白酶解后的溶解性、吸油性、发泡能力优于大豆分离蛋白，木瓜蛋白酶水解产物的保水性、乳化活性及稳定性优于大豆分离蛋白。

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