甾类药物生物脱氢技术研究新进展

郑书香,王荣柱,谢松霖,何军邀,王 普

(浙江工业大学 1.健行学院,2.药学院,浙江 杭州 310014)

甾类药物生物脱氢技术研究新进展

郑书香1,王荣柱2,谢松霖2,何军邀2,王 普2

(浙江工业大学 1.健行学院,2.药学院,浙江 杭州 310014)

甾类药物是医药工业中重要的一大门类,通常以甾体母核结构为基础,通过化学法或生物法合成,其中微生物转化是许多甾类药物或其中间体合成路线中关键的环节。此文对甾类药物生物转化脱氢反应涉及的催化剂类型、转化率提高的途径、新型生物脱氢反应体系等方面进行了综述。

甾类药物;微生物转化;脱氢反应

甾体类药物是医药工业中重要的一大门类,具有抗过敏、抗休克、抗病毒等作用,被广泛用于治疗风湿关节炎、心血管疾病、肿瘤、皮肤病、内分泌失调、肌松等。

甾类药物通常以甾体母核结构为基础,通过化学法或生物法合成。微生物转化法具有成本低、副产物少、对环境污染低等优点,故甾类合成中越来越多引入生物转化法。目前,微生物转化甾类药物中涉及较多的是羟基化、还原、脱氢、芳构化、边链切除等。本文就甾类药物生物转化脱氢反应体系所涉及的催化剂类型、如何提高转化率,以及新型脱氢反应体系进行综述。

1 生物催化剂类型

1.1 游离细胞

在两相体系或单相体系中,将游离细胞直接作为生物催化剂的研究最为普遍,它不仅操作简便,而且游离细胞可维持较高酶活,利于辅酶再生[1]。张艺等[2]研究了含有不同基团的甾体底物在不同反应体系中的生物脱氢规律,结果表明,保持细胞的完整性对 C1,2位脱氢转化至关重要,细胞破碎会破坏细胞膜限制性酶,导致转化率的降低。

1.2 固定化细胞

在有机溶剂-水或离子液体-水两相体系中的甾体脱氢研究中,将固定化细胞作为催化剂,不仅利于生物催化剂与产物的分离以及细胞的重复使用,还可降低有机溶剂等对细胞的毒性,维持酶的活性。Park等[3]利用不同疏水性凝胶固定化简单节杆菌,研究凝胶的疏水性对催化氢化可的松脱氢反应的影响,结果发现凝胶的疏水性越大,底物越易进入到疏水区域,这可减少底物抑制,提高转化率。张瑛等[4]探索了不同方法制备固定化简单节杆菌催化醋酸可的松,发现用聚乙烯醇-海藻酸钙复合甾体包埋的细胞,具有机械强度高和酶活较高的优点,在最适温度 34℃、最适 pH 7.5条件下,当底物浓度为 20 g/L时,反应 18～20 h,转化率达 98%。

1.3 解冻细胞

Smolders等[5]以热干和解冻的简单节杆菌细胞为生物催化剂,研究了微乳体系中高浓度 16-甲基-莱氏化合物 S-21-醋酸酯 (16MRSA)的脱氢反应,发现解冻细胞在转化 14～16 h后转化率可达 98%,细胞干重浓度分别为 40 g/L,而热干细胞转化相同时间的干重仅为 10 g/L。

1.4 转基因表达

简单节杆菌 3-甾酮-1-脱氢酶 (KSDH)也称甾体 C1,2位脱氢酶,编码该酶的全基因序列已被测出,许多学者将其克隆到其他菌种中,以提高该酶的基因表达量等。李玉等[6]将其重组到大肠杆菌中,超声破碎的细胞破碎液对 4-烯-雄甾-3,17-二酮 (4-AD)的转化率较简单节杆菌提高了近 10倍。

1.5 原生质体转化

甾体脱氢酶多为胞内酶,细胞壁 (细胞膜)通透性将成为影响传质的主要障碍,采用原生质体转化技术有助于克服这一困难。张艺等[2]研究了简单节杆菌原生质体催化甾体脱氢,发现以醋酸氢化可的松为底物的脱氢转化率较高,而其他甾体化合物如可的松、甲睾酮和睾丸素等转化率很低,其原因在于原生质体在高渗液中不稳定、易破裂,从而造成脱氢酶释放被稀释,导致转化率降低。采用原生质体进行甾体脱氢的报道较少,且转化效果不理想。而利用原生质体进行甾体羟基化反应的报道相对较多,且转化效果较好。

1.6 高产菌株的筛选

王敏等[7]和赵荣等[8]利用原生质体紫外线诱变结合底物抗性筛选方法选育得到高产菌株,氢化可的松转化率分别达到 73.6%和 81.63%,较出发菌株分别提高了 54%和14.1%。

2 改进反应体系以提高转化率

2.1 温度

温度是影响酶或细胞催化的生物反应的重要因素之一。葛翔等[9]利用简单节杆菌对甲基可的松进行脱氢研究,发现在 30～37℃间,底物转化率先随着温度的升高而增加,之后随着温度的继续升高而降低,在 33℃左右,底物转化率达较高值。酶反应 (细胞催化实质上也是酶反应)速率是随反应温度上升而增加,但同时酶变性的速率也会增加;当温度超过某点 (最适温度)时,酶变性引起的速率下降量会超过本身因温度上升引起的速率增加量,据此,通过考察不同温度对生物催化剂催化底物脱氢的影响可确定其最适反应温度。

2.2 pH

pH对酶或细胞催化的生物反应的影响与温度类似。葛翔等[9]发现在 pH为 7.0附近处底物转化率达到最大值(52%);当 pH分别为 3.0和 10.5时,转化率都接近于零。王普等[10]优化简单节杆菌 17α-羟基 -16β-甲基 -孕甾 -4,9(11)二烯-3,20-二酮脱氢酶产酶条件时,发现当培养基初始pH值为 7.0时,酶活力最高。酶催化时主要靠活性部分的催化基团和底物结合基团,pH是通过改变这些基团的带电性质从而影响酶促反应过程的。一般甾体脱氢酶催化反应的最适 pH值接近中性,大部分为 6～8。

2.3 增加底物溶解度

2.3.1 改进底物投料方式 目前甾体脱氢反应遇到的最大困难在于底物在水中的溶解度极低。底物难溶不但会造成产量的低下,有时还会引起反应速率慢和转化率低的问题。有人从改进底物投料方式以提高转化率,葛翔等[9]测定的6α-甲基可的松的饱和溶解度为 0.172 g/L,通过将底物进行超声波粉碎,乳化后投料进行微生物脱氢,以减少有机溶剂对细胞的毒害作用,减少底物从固相到液相的传质阻力。马书章等[11]研究了促溶剂对甲基睾丸素脱氢的影响,发现选用 4%甲醇和 0.01%吐温 80作为混合促溶剂时,转化率提高至 81%。Fernandes等[12]考察了表面活性剂对转化体系的影响,发现一方面表面活性剂能在有机溶剂和水两相界面形成微乳,降低传质阻力,另一方面水相中胶束的形成降低了甾类产物在有机溶剂和水两相的分配系数,有利于反应的进行,但不利于产物的回收。因此,常通过加入表面活性剂或促溶剂改变溶液性质以增加底物溶解度,加快传质。

2.3.2 底物微粉化 底物溶解度与物料的比表面积有关。采用微粉化技术减小粒径,使之达到微米级甚至纳米级,可有效提高难溶性底物溶解度,增加底物与菌体接触的表面积,提高转化率,增加底物投料浓度。如醋酸可的松的投料,工业上常用气流粉碎底物,直接加料,然后加入乙醇助溶,投料浓度可提高至 7%,底物转化率达 90%以上[13]。用赫曲霉进行黄体酮 11α羟化时,投入微粉化的底物 (90%颗粒小于 10μm),则底物浓度可提高到 1.5%～4%[14]。阳葵等[15]研究底物的分散和溶解对甾体微生物酶反应的影响时,发现超声处理与分散剂配合使用效果较佳,认为超声处理使底物高度细化,而分散剂的加入不仅可使底物分散,而且能消除因超声造成的体系不稳定性。

2.4 解除底 (产)物抑制作用

高浓度的底物或产物都会对酶产生一定的抑制作用。龚万本等[16]考察了简单节杆菌催化 6α-甲基醋酸可的松C1,2脱氢动力学,发现较高的底物浓度和产物浓度均会对脱氢反应产生抑制作用。A rinbasarova等[17]研究了 Arthrobacter globiformis 193对 6α-甲基可的松 1-烯-脱氢酶的生化反应特征,发现反应遵循多底物抑制模型,并且主要抑制呼吸链。为减少该抑制作用,可考虑采用新型的脱氢反应体系,以降低产物对反应的抑制作用。

2.5 环糊精

环糊精是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称,通常含有6～12个D-吡喃葡萄糖单元。环糊精可用于促进底物溶解和增加脱氢酶的活性,在甾类的生物脱氢方面具有很好的研究价值。环糊精对甾体脱氢的影响有较多报道。

申雁冰等[18]研究了羟丙基 -β-环糊精 (HP-β-CD)对植物甾醇侧链生物转化反应的影响,结果表明添加 HP-β-CD构建成一种新的超分子介质体系可以提高分歧杆菌降解植物甾醇生物转化反应的反应速率和摩尔转化率,转化 168 h时植物甾醇摩尔转化率达到 89.9%,较对照实验提高了 3.1倍。这可能由于β-环糊精能与甾体化合物形成镶嵌复合物,增大溶解度,加速底物向细胞转移过程,从而显著加速微生物转化[19]。Wang等[20]以简单节杆菌生物脱氢可的松醋酸酯为模型,评估了 HP-β-CD对甾体Δ1-脱氢的影响,结果显示,HP-β-CD对Δ1-脱氢酶具有促进作用,不但能提高反应速率,而且能提升最终的底物转化率,因为 HP-β-CD具有良好的生物相容性,同时还能够提高底物和产物的溶解度,更能缓解产物的抑制作用。

2.6 其它

提高转化率其中重要的途径之一是对培养基进行优化。常用的方法有正交实验法、响应面法和遗传算法。王普等[10]利用正交优化后的结果进行验证试验,比原先的最佳培养基所得酶活提高了 8%。另外,加入某些微量金属离子亦可以增加转化率 ,如 Mg2+、Co2+、Fe2+、Mn2+、K+、Na+、Ca2+。Adham等[21]发现 K+、Na+、Ca2+、Mg2+以适宜的浓度能够促进 尼松龙的生产,荧光假单胞菌内的Δ1-脱氢酶可被 EDTA明显加强,该培养基的优化不仅使波尼松龙产量提升 1.3倍,而且副产物羟基 尼松龙的产量下降了 50%,这可能是螯合试剂 (EDTA)对其中的强化酶有抑制效果,该研究还发现枸橼酸钠和甲苯酸纳能够诱导Δ1-脱氢酶的产生。由此可见,不同的金属阳离子和有机阴离子对脱氢酶的活力也有一定的影响。适宜的离子对脱氢反应有促进作用。

3 新型脱氢反应体系

3.1 微乳体系

微乳一般由水、油、表面活性剂和助表面活性剂按适当的比例混合,为热力学稳定的透明分散体系。杨玉芬等[22]采用简单节杆菌 Arthrobacter simplex UR016菌株,构建Tween-80/乙醇 /食油 /水微乳体系,通过改善底物传质,提高11-羟基甲羟孕酮 C1,2位的脱氢转化率,Tween-80在体系中作为表面活性剂,为底物在水相和油相之间传递充当了媒介,提高了脱氢反应速率。Smolders等[5]利用微乳体系进行高浓度的 16-甲基-莱氏化合物 S-21-醋酸酯的 C1,2脱氢反应,反应 14～16 h后转化率可达 98%。Goetschel等[23]构建了脂质体反应介质,利用简单节杆菌对氢化可的松进行脱氢反应。由于高疏水性的甾类底物被包裹在脂质体中,所以底物和产物具有较好的传质,而脂质体的主要成分为磷脂,所以它又能与细胞具有较好的接触,促进反应的进行。

3.2 双水相体系

双水相体系是指两种不同的高聚物或一种高聚物和一种无机盐在水中以适当的浓度溶解而形成的互不相容的两液相体系,具有生物相容性高、反应条件温和以及实现生物反应-产物分离耦合等优点。孙新宇等[24]利用简单节杆菌在 PEG/Dextran双水相体系中对 6-甲基氢化可的松进行脱氢,研究得到最佳转化体系组成和配比为 16%PEG 20000/4%Dextran 40000时,甲基氢化可的松的转化率可达95.72%。

3.3 有机溶剂-水两相体系

有机溶剂的加入主要是增加底物和产物的溶解度,并且可以储存底物和产物,对水相进行萃取,解除底 (产)物对脱氢酶的抑制。Fernandes等[12]研究了简单节杆菌游离细胞在有机溶剂 /水两相体系中生物转化 6-α-甲基氢化可的松-21醋酸酯的反应,综合考虑了甾体的溶解度和生物相容性,发现正辛醇为最佳溶剂。Jiradej等[25]考察了固定化细胞对反应的影响,观察到海藻酸钙对疏水性底物具有强烈的传质阻力,因此转化率都较相应的游离细胞催化脱氢的结果低。有机溶剂的存在,引起微生物细胞中的辅酶再生系统会失活,Bie等[26]构建的 30%四氟化碳-70%磷酸钾缓冲液两相体系,加入维生素 K作为外源电子受体,简单节杆菌的脱氢转化率达 95%。不可否认,有机溶剂对微生物细胞存在不可忽略的毒副作用。通过加入外源电子受体,构建人工电子传递链,可使氧化还原反应得以正常进行。

3.4 含离子液体体系

离子液体具有接近为零的蒸汽压、热稳定性、可通过设计阴阳离子改变本身性质等特性,已受到越来越多学者的关注[27]。Xie等[28]对离子液体对简单节杆菌生长毒性进行了研究,结果发现含三氟阴离子的离子液体对菌体毒性最大,离子液体 1-乙基-3-甲基咪唑 L-乳酸盐 ([Emim][lactate])、1-丁基-3-甲基咪唑 L-乳酸盐 ([Bmim][lactate])在低浓度(小于 2.5×10-3mol/L)下对简单节杆菌生长毒性较小,可作为整细胞催化甾类药物脱氢的理想溶剂。He等[29]将离子液体以共溶剂形式添加到 Tris-HCl缓冲液 /甲苯两相体系中,研究该体系对简单节杆菌转化 11β-羟基甲孕酮脱氢的影响,发现相体积比为 5∶2,添加 1-丁基-3-甲基咪唑 L-乳酸盐 20 g/L,转化 16 h后,转化率达 80.9%,较未添加离子液体的体系提高了 20.9%。M ina等[30]以离子液体 1-丁基-3-甲基咪唑 L-乳酸盐为辅助溶剂,加入甲酸盐脱氢酶与 3α-羟基甾体脱氢酶形成偶联酶系统,重现辅酶再生,使产率提高了近 2倍。

4 结 语

脱氢反应是甾体化合物生物转化合成中重要的反应之一,脱氢产物如去氢甲基睾丸素、醋酸泼尼松等都是广泛应用的药物。目前甾类脱氢转化主要难点是如何提高底物的溶解度,解除底物、产物对反应的抑制作用等,上述甾类药物生物脱氢新技术的应用,在增强底物溶解度,强化反应过程的传质,提高转化率方面取得了较好的效果,特别是近年来新兴的含离子液体的反应体系,以及加有环糊精的甾类生物脱氢体系,具有较好的应用前景。甾体脱氢酶序列的测定以及基因重组技术的应用,有望获得高产酶菌株。相信随着研究的深入和更多的提高甾类脱氢转化率新技术、新方法的应用,甾体药物的生物脱氢技术将会有更大的发展。

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Research progress in biodehydrogenation technique of steroid medicine

ZHENG Shu-xiang1,WANG Rong-zhu2,X IE Song-lin2,HE Jun-yao2,WANG Pu2
(1.Jianxing School,2.School of Pharmaceutical Science,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China)

TQ463

A

1005-1678(2011)03-0251-04

2010-03-01

国家大学生创新性实验项目;浙江省自然科学基金项目(No.Y407289)

郑书香,女,本科生,生物制药专业,E-mail:shuxiangzheng@gmail.com;王 普,女,通信作者,教授,E-mail:wangpu@zjut.edu.cn。