抑肽酶对实验性慢性肝损伤肝组织纤维化影响的研究

王心童,王虹蛟,王 强,孟威宏,颜炜群

(1.吉林大学白求恩医学院,吉林 长春 130021;2.长春解放军第461医院,吉林 长春 130021;3.沈阳军区总医院;4.吉林大学再生医学科学研究所）

关于肝纤维化机制及防治研究,目前是国内外生物学、医学研究的热点之一[1-6]。本论文利用实验鼠的四氯化碳(CCl4）慢性肝损伤模型,同时利用胶原纤维染色检测方法观察抑肽酶对实验性慢性肝损伤大鼠肝组织纤维化改变的影响,并对其作用机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wister大鼠,雌雄兼用,由长春高新医学动物研究中心提供,合格证号:医动字第1055118。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠慢性CCl4肝损伤模型的建立 Wister大鼠,体重190-210 g,雌雄各半,由高新实验动物中心供应。本实验采用新鲜的花生油作为溶剂。将25%CCl4溶解于花生油中混匀。正常对照组仅皮下注射花生油5 ml/kg,其它各组大鼠首次给予CCl4原液5 ml/kg,以后每周2次25%CCl4液(花生油稀释）5 ml/kg皮下注射。禁食,不禁水。

1.2.2 动物分组及给药 (1）第1组为正常对照组:腹腔注射等量生理盐水。(2）第2组为慢性肝伤损模型组:腹腔注射等量生理盐水。(3）第3组为抑肽酶小剂量组:腹腔注射抑肽酶2万KIU/kg。(4）第4组为抑肽酶中剂量组:腹腔注射抑肽酶4万KIU/kg。(5）第5组为抑肽酶大剂量组:腹腔注射抑肽酶8万KIU/kg。(6）第6组为促肝细胞生长素注射液组(阳性组）:腹腔注射促肝细胞生长素100 mg/kg。3-5组每天给予抑肽酶一次,连用4周,第6组每天给予促肝细胞生长素一次,连用4周。禁食,不禁水。

1.2.3 胶原纤维染色 末次给药1小时后处死大鼠,取肝大叶相同部位的一小块肝组织固定于10%福尔马林,常规法制做组织切片,利用Masson氏染色法染色进行胶原纤维染色后,在光镜下观察肝细胞变性坏死程度、肝间质纤维增生程度。利用Olympus图像分析软件自动分析蓝染胶原面积。

1.2.4 统计学处理 实验数据以¯x±s表示,各组之间数据比较均采用两组资料秩和检验的方法。

2 结果

利用Masson氏染色法染色肝组织胶原纤维以评测肝组织纤维化程度。胶原纤维被染为蓝色或绿色,其它细胞、组织以红色着色为主。利用Olympus图像分析软件自动分析蓝染胶原面积。空白对照组极少见着色的胶原纤维,仅在血管周围可见少量蓝染胶原纤维区域,相对胶原面积为(0.9±0.01）%。模型对照组胶原纤维增生明显,穿插肝组织形成较为明显的假小叶,胶原纤维总面积大,相对胶原面积为(27±3.12）%。抑肽酶小剂量组胶原纤维增生明显,相对胶原面积为(25±3.81）%,同模型组相比无明显减轻趋势。抑肽酶中剂量组,胶原纤维增生以局部多见,较少相互交叉形成假小叶,相对胶原面积为(19±5.18）%,与模型组相比胶原面积显著减少(P＜0.05）。抑肽酶大剂量组,胶原纤维增生较轻,汇管区及血管周围可见轻度胶原纤维增生,无假小叶形成,相对胶原面积为(6±1.93）%,与模型组相比显著降低(P＜0.05）。促肝细胞生长素组胶原纤维增生明显,以汇管区居多,假小叶形成较少,相对胶原面积分别为(24±9.8）%。与模型组相比显著降低(P＜0.05）。并且随着抑肽酶剂量的增加,胶原纤维增生减轻。尤其以抑肽酶大剂量组效果最为明显,优于促肝细胞生长素组。实验结果显示,抑肽酶能够显著抑制大鼠肝脏纤维化。

3 讨论

肝纤维化的形成是一缓慢而复杂的过程,不论何种致病因素,其机制都是肝脏受到外界刺激后引起细胞因子的释放,细胞因子-细胞-细胞外基质相互作用,使肝脏细胞外基质代谢紊乱,在狄氏间隙过沉积,继之肝窦毛细血管化是形成肝纤维化的分子病理学基础。最终使基质沉积于肝脏。TGF-β在肝纤维化中的作用:TGF-β是一组具有多种功能的蛋白多肽。在肝纤维化时它能刺激细胞Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、ⅩⅧ型等大多数胶原mRNA水平的提高或蛋白产物的增加,并有调节肝脏再生的能力。肿瘤坏死因子α(TNF-α）:在体外TNF-α可以促进成纤维细胞及星状细胞的增殖与转化。白细胞介素族(IL-1、6）:IL-1主要由单核巨噬细胞产生,它能刺激成纤维细胞和HSC产生胶原。IL-6有较强的促进HSC增殖的作用,使细胞外基质的合成总量增加,IL-6还能促进α-2巨球蛋白的表达,抑制胶原酶活性,导致肝内胶原沉积。活化的枯否细胞可产生氧自由基从而损伤肝细胞,肝细胞损伤可引起肝星状细胞活化。肝细胞能产生多种细胞因子,如成纤维细胞因子、转化生长因子α、白介素-1、6、8及单核巨噬细胞集落刺激因子等。肝细胞通过将无生物活性的物质代谢为致纤维化物质而发挥作用。

CCl4致慢性肝损伤的主要机制是CCl4在肝细胞内产生三氯甲基自由基,引起脂质过氧化以及直接的膜溶解作用,使肝细胞坏死。CCl4可经肝内微粒体酶活化生成自由基,通过脂质过氧化物作用损伤破坏肝细胞,致使血清ALT、AST水平显著增高。肝功能受损后,肝细胞制造白蛋白(A）的能力降低,引起A/G比例下降。CCl4慢性肝损组大鼠,正常肝小叶结构破坏,有广泛的脂肪变性、肝细胞坏死及不同程度的间质纤维增生。

本实验模型对照组胶原纤维增生明显,穿插肝组织形成较为明显的假小叶,胶原纤维总面积大。促肝细胞生长素组胶原纤维增生明显,以汇管区居多,假小叶形成较少。抑肽酶小剂量组胶原纤维增生明显,同模型组相比无明显减轻趋势。抑肽酶中剂量组,胶原纤维增生以局部多见,较少相互交叉形成假小叶,与模型组相比胶原面积显著减少。抑肽酶大剂量组,胶原纤维增生较轻,汇管区及血管周围可见轻度胶原纤维增生,无假小叶形成。并且随着抑肽酶剂量的增加,胶原纤维增生减轻。尤其以抑肽酶大剂量组效果最为明显,优于促肝细胞生长素组。

抑肽酶是一种是广谱的非特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂,被广泛用于体外循环的心血管手术和多种疾病的治疗[7-15]。目前国内外对抑肽酶保护肝损害的研究主要集中在:实验性大鼠肝缺血再灌注损伤、人的肝癌切除术和原位肝移植的保护作用机制的研究。但目前国内外尚未见到有关抑肽酶对实验性慢性肝损伤大鼠肝组织纤维化改变方面的报道。本实验通过利用胶原纤维染色检测方法观察,显示抑肽酶对大鼠慢性CCl4肝损伤模型具有很好的保护性作用,明显减轻慢性肝损伤的程度,抑制肝纤维化的发展。尽管其作用机制还不清楚,但从本实验的结果可以认为是从减轻肝细胞的损伤及抑制肝纤维化的发展两个方面对慢性肝损伤起到保护性作用的。

[1]Kaplowitz N.Mechanisms of liver cell injury[J].J Hepatol,2000,32(1 Suppl）:39.

[2]Patel T,Gores GJ.Apoptosis and hepatobiliary disease[J].Hepatology,1995,21(6）:1725.

[3]Scaffidi C,Fulda S,SrinivasanA,et al.Two CD95(APO-1/Fas）signaling pathways[J].EMBO J.1998,17(6）:1675.

[4]王虹蛟,张馨木,常淑芳,等.抑肽酶对小鼠急性肝损伤的保护作用[J].中国实验诊断学.2005,9(3）:420.

[5]孟威宏,王虹蛟,张馨木,等.口服抑肽酶对大鼠急性肝损伤的保护作用[J].吉林大学学报医学版,2006,32(3）:370.

[6]王虹蛟,孟威宏,王强,等.抑肽酶对实验性慢性肝损伤的保护作用[J].中国实验诊断学,2008,12(1）:4.