疾病体外检测和诊断技术的新发展

唐时幸，康可人，李银太

·述评·

疾病体外检测和诊断技术的新发展

唐时幸，康可人，李银太

从全球范围来看，疾病体外检测、诊断试剂的需求在不断增长，年增长率达到 5.5％；我国诊断试剂的市场增长率达到近 20％[1]。特异、敏感和快速的疾病体外检测和诊断方法是预防和治疗疾病的重要手段和前提。一些新的检测技术和平台正逐渐应用于疾病的检测和诊断，引起了越来越多的关注。随着纳米技术（nanotechnology）和材料的兴起与蓬勃发展，依赖纳米材料和技术的新的疾病诊断方法的研究正在成为疾病检测和诊断的热点；基于纳米材料和技术的新的疾病诊断方法可能成为新一代疾病体外检测和诊断方法而受到世界各国的广泛重视。其他像芯片技术（microarray chip）、微流控技术（microfluidic device）和生物传感器（biosensor）等也开始应用于疾病的体外检测，这些新技术相互结合为新的疾病检测方法研发提供了更多的选择。

1 纳米材料与技术

一般讲，纳米技术指的是基于原子和分子水平的研究而导致的在纳米标尺（1 ～ 100 nm）的结构和系统的发展和实际应用[2]。更重要的是这些纳米标尺的结构和系统因为其独特的大小而拥有了新的性质和功能。纳米材料所拥有的独特的性质和功能使它们能被用来解决一些我们以前的技术所无法解决的问题，这就是这项新技术的生命力所在。比如不同大小的纳米颗粒显现的不同颜色的荧光信号，使之非常方便用于多指标的同时检测。Agrawal 等[3]采用两种不同大小的量子颗粒（quantum dots）标记抗呼吸道融合病毒（RSV）抗体，用于同时检测病毒表面的不同蛋白，只需单个激发光源，就能同时获得两种不同的荧光信号，根据这两种信号强度的差异，就可以区分变异病毒株，或者是判断病毒表面病毒蛋白分子数量，是一种非常简单、快速、敏感的多指标检测方法[3]。纳米颗粒在一定条件下发生聚集而导致纳米溶液颜色的改变，这一变化可以直接用于样本中生物标志物的检测[4]。比如纳米金颗粒标记上特异性抗体或寡核苷酸链后，分散状态的纳米金颗粒溶液呈现淡红色。在特异的抗原或核酸存在时，纳米金颗粒借助抗原抗体或核酸链杂交结合在一起，聚集的纳米金颗粒溶液也因此由淡红色转变为紫色或黑色，借助纳米溶液的颜色变化，就能判断样本中特定的生物标志物。此外，纳米颗粒标记上核酸后可明显提高核酸杂交的温度，因而提高核酸检测的特异性等。纳米科技与生物科学、医药学的结合，正迅速成为新的热点和前沿领域。纳米医学将推动基因治疗、分子靶向治疗研究和疾病诊断的快速发展。在疾病检测和诊断方面，纳米材料和技术的应用在提高检测方法和诊断的敏感性和特异性方面展现了很好的前景。目前研究的重点在：

⑴纳米材料的合成和修饰。早在 20 世纪 70年代末期纳米金颗粒就被用于组织学免疫染色，当时称为胶体金（gold colloid），主要是利用抗原、抗体同纳米金颗粒的物理吸附将它们标记在金颗粒表面，用于相应的免疫组织化学检测。由于对这类材料研究不多，胶体金的应用范围非常有限。到 20世纪 90 年代末期，纳米技术和纳米材料被列为美国国家发展战略计划后，对这类新材料和技术的重视迅速升温，纳米材料的合成与修饰、标准化分析、对环境和人体健康的影响等研究迅速发展成为一门专门的学科，多种多样的纳米材料被研发出来，大大促进了纳米技术的发展和应用。比如把有机的荧光分子加入到纳米颗粒中，每个纳米颗粒可包含上万个荧光分子，这样可以大大提高荧光信号的强度，因而提高检测的敏感性。此外，在纳米颗粒内部，荧光分子被疏水分子层隔离，增加了荧光分子的稳定性，减少了高浓度荧光分子产生的“漂白”现象[5]。再比如借助纳米颗粒相对较大的表面积，在其表面标记少量的抗体和数十个，乃至上百个寡核苷酸链，借助抗原抗体的特异结合来检测特异抗原，通过测定纳米颗粒表面的寡核苷酸链来实现信号的放大，因而提高检测的敏感性[6-7]。Tang 等[6]在 20 nm 金颗粒表面标记上抗 HIV p24 抗体和随机寡核苷酸链用于检测 p24 抗原，每一个金颗粒表面可以结合约 70 个核苷酸分子。这样理论上每一个抗原抗体分子结合反应，将有 70 个核酸分子被释放出来，因此蛋白信号也放大了至少 70 倍。同样也可以在合成脂质体（liposome）纳米颗粒时，把寡核苷酸链包括在纳米颗粒中心，最后检测时把结合在抗原抗体复合物上纳米颗粒溶解，释放出其中的寡核苷酸链，通过检测释放的核酸链用于信号的放大检测[8]。尤其是用 PCR 方法进一步放大所释放的核酸链，检测的敏感性将进一步提高。其他像在纳米颗粒表面添加适当的化学基团，通过化学反应来实现抗原-抗体的共价结合，提高标记的特异性和稳定性等，可以进一步提高基于纳米材料的检测试剂产品的稳定性和改善质量控制。

纳米材料指的是直径在 1 ～ 100 nm 的新材料，从形状和结构区分包括纳米颗粒（nanoparticle）、纳米管（nanotube）和纳米膜（nanofilm）；从来源看包括合成的纳米颗粒、偶遇的纳米颗粒和自然存在的纳米物质（像病毒颗粒和病毒蛋白形成的纳米级颗粒等）。纳米碳管的直径 ＜ 100 nm，但其长度可以达到微米级，整个表面积远远大于单个纳米颗粒，更适合标记许多大的蛋白分子。比如 Wang 等[9]在 1 μm 长的纳米碳管上标记 9600 个辣根过氧化物酶，用于免疫学检测，检测 IgG 的浓度可达到 500 fg/ml，其敏感性就远远大于常规的酶联免疫学检测。一些自然存在的蛋白纳米颗粒，比如乙型肝炎病毒表面抗原形成的丹式颗粒，更容易消化、分解，对环境的影响和破坏会更小，应该给予更多的关注。纳米材料的物理、化学和生物学性质和功能都不同于大分子材料，一些利用纳米材料的检测方法，其敏感性和特异性较传统方法有很大的提高，被越来越多地应用，与纳米材料独特的理化性质密不可分。新的纳米材料的发现、合成、应用，是推动以纳米材料为基础的新检测方法研发的重要环节，也是纳米材料科学研究的重要内容，有很多基础理论问题需要解决，需要化学、高分子材料、物理学、生物学等多学科的相互配合。当然，纳米材料的毒性和对环境的影响，也越来越受到关注，期待深入研究阐明。

⑵纳米材料与传统检测方法的结合。现代疾病检测方法经历了生化、酶化学、免疫学、核酸分子杂交和核酸基因体外扩增及序列分析等几个阶段，相应建立了许多检测平台，如胶体金快速检测试纸、酶联免疫方法和多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）等，这些原有的检测平台与新的纳米材料结合，大大改善了原有方法的敏感性和特异性，而成为新的检测平台和系统。比如在2007 年我们研发的利用纳米金颗粒和银染色检测艾滋病病毒核衣壳蛋白的方法，是在原免疫学检测方法基础上改进的，用纳米金颗粒取代传统辣根过氧化物酶催化底物显色，改进后的方法检测敏感性是原方法的 100 ～ 150 倍，能提前 3 ～ 4 天检测出艾滋病病毒感染[6]。在2009 年，我们又用铕荧光纳米颗粒（europium nanoparticle）取代纳米金颗粒，因为一个铕纳米颗粒含有 3 万个荧光分子，能产生很强的荧光信号，改进后的方法检测敏感性比传统的酶联免疫方法提高 100 倍[5, 10]。Mason 等[8]把纳米颗粒与 PCR 方法结合检测霍乱毒素 β 亚单位，解决了蛋白质无法在体外扩增的难题，通过 PCR 扩增纳米颗粒中携带的寡核苷酸链分子，实现对待检测毒素分子的间接放大，可以检测到0.02 fg/ml（相当于 10 个分子）。

⑶纳米材料同新检测技术的结合。纳米材料也被大量用于一些新的检测方法和平台，像基因芯片技术、生物传感器和微流控装置等。在 2010 年我们发展了一种全基因的基因芯片检测技术，该方法是直接将待检测的核酸加到基因芯片上进行杂交，借助标记在纳米金颗粒表面的核酸探针与待检测的核酸分子杂交，再通过银显影液还原在纳米金颗粒表面形成银壳来“显色”，其敏感性可以接近 PCR水平[11]。由于待检测的核酸不需经过 PCR 放大，检测所需时间大大缩短，也不用担心 PCR 方法中常见的“污染”问题。我们在检测流感病毒时发现，如果待检测样品中的核酸量足够大的话，杂交后形成的银壳很大，结果可以直接用肉眼判读或是借助简单的仪器判断，不需要贵重的仪器设备。如果增加银“染色”次数或是选择用还原金颗粒在原来的金颗粒表面再形成一层金壳，因为还原后的金壳比银壳更大，检测的敏感性也因此更高。最后，纳米金颗粒可以提高核算杂交的温度，因此可以提高检测方法的特异性，减少假阳性，可以用于单个碱基突变的基因诊断。目前我们用该技术检测流感病毒、西尼罗河病毒和 AIDS 病毒，可以检测到1000 个病毒颗粒，比传统的基因芯片杂交方法简单、快速[11]。Chin 等[12]将金颗粒加银染色方法与微流控技术结合建立了快速检测HIV和梅毒的移动微流控芯片（mobile microfluidic chip，mChip）方法，只需要 1 μl 全血，该方法已经在非洲现场应用，检测 HIV 和梅毒的敏感性分别为 100％ （95％ 的可信限范围为 98.6％ ～ 100％）和 95％ （85.4％ ～ 100％），特异性分别为 100％（99.2％ ～100％）和 81％（64.2％ ～ 97.7％）。

近十年来基因芯片技术（microarray technology）被越来越多地用于疾病诊断，其最大的优点是可以同时检测多个疾病指标。但目前核酸检测的基因芯片技术基本上是 PCR 和核酸杂交方法的结合，是先用 PCR 方法对待检测的核酸加以放大，再通过核酸杂交方法来确定样本中存在何种疾病的核酸。因此它仍然没有克服 PCR 和核酸杂交技术的一些缺点。相反，基因芯片技术本身比较复杂，目前很难常规开展。此外，传统的蛋白质芯片技术用蛋白（抗原或抗体）来检测疾病标志，问题是没能在体外对蛋白标志物进行放大，检测信号较弱，因而没能提高检测的敏感性。纳米颗粒用于标记和芯片检测，可以明显改善检测的敏感性和特异性。这些新技术和材料的结合应用，将促进芯片技术在疾病检测的应用。

生物传感器（biosensor）是一类特殊的传感器，它以生物活性单元（如酶、抗体、核酸、细胞等）作为生物敏感单元，将生物反应或是理化反应过程转变成容易获取和识别的光、电信号的分析装置。最常用的生物传感器就是血糖检测仪，其利用葡萄糖氧化酶催化血糖降解，产生的电子被电极捕获而感知血糖及其浓度。实际上，血糖检测试纸也是最简单和最常见的微流控装置。生物传感器也大量应用纳米材料于检测中，像利用表面等离子共振技术（surface plasmon resonance，SPR）检测表面生物物质的方法，在结合纳米颗粒或是对表面进行适当处理后，SPR 信号差异就明显加大，相应的检测平台就更加实用。生物传感器非常适合用于疾病快速检测和诊断，因此是快速检测试剂（point-of-care，POCT）平台常用的技术。

2 微流控装置

微流控是研究在微米甚至纳米级微小环境中液体流动的原理、精确控制和应用。微流控装置（microfluidic device）就是由若干微细管道（其中至少一个管道的直径小于 1 mm）组成的网络样结构，液体的流动受若干控制阀门的控制。简单说就是一张芯片上的实验室（lab-on-a-chip），能够把需要在实验室完成的多步反应放在由很多管道组成的若干个分区的玻片（或其他材质）上完成[13]。因为样本和液体在狭窄的管道中流动和混合，分子间接触和碰撞加快，反应可以快速完成，缩短了检测时间。此外，狭小的反应空间决定了相对小的反应体积，所需的样本量和试剂等相应减少，一是可以减少对样本的需求，便于检测一些很难获取的样本；二是可以减少试剂用量，降低成本。微流控装置的最大特点是容易实现自动化检测，减少对实验室和检测人员的依赖，只需将待检测样品加入检测孔，整个检测过程就能自动完成，检测结果的稳定性和可靠性也因此得到保障。从 20 世纪 80 年代开始，微流控技术主要用于喷墨打印机，现在被广泛用于制备基因芯片、临床检测的微流控装置等。应当看到微流控技术是未来疾病检测方法的一个很有潜力的平台，微流控技术正是一个冉冉升起的新兴产业，到 2013 年其市场价值可达到 10 亿 ～30 亿美元[14-15]。几项新的进展如下：

⑴探索采用新的、廉价材料，如采用纸作为支撑物，研发适用于基层、资源贫乏地区以及快速检测试剂（POCT）。比如美国西雅图大学 Yager 博士实验室近年来研发的二维纸网络（2 dimentional paper-based networking，2-DPN）检测系统，在原来的 POCT 检测试纸基础上进行改进，增加了洗脱和增强染色等步骤，进一步提高了检测的敏感性[16-17]。哈佛大学 Whitesides 博士的实验室研发的硝酸纤维素膜微流控系统，用于血糖等的检测，能匹配现有的血糖检测仪，敏感性达到 4 mg/ml[18-19]。建立在硝酸纤维素膜上的芯片检测方法，利用毛细管层析原理，进行芯片检测，对传统芯片系统是巨大的改变，在多指标检测中展现了很好的应用前景。

⑵核酸快速检测系统。简单的微流控系统用于蛋白和小分子检测，已经有很多的报道。近年来用于核酸的快速检测，把样本处理、核酸提取、扩增和检测放在同一个微流控装置中实现，并同传统的利用纳米金颗粒显色的快速检测系统结合，实现核酸的快速检测。英国剑桥大学 Lee 博士实验室报道，采用同温核酸放大和金颗粒标记加免疫层析分析快速检测方法建立了一种简单放大方法（simple amplification-based assay, SAMBA），可以在现场快速检测、肉眼观察结果，能检测到 500 拷贝/ml 的HIV-1 核酸，只比传统的 PCR 方法差 10 倍左右[20]。纳米材料与微流控技术结合的核酸快速检测方法因其简单、快速，相应的核苷酸链易于合成，特别适合快速建立新的检测方法，为公共卫生突发事件中病原体的快速检测和鉴定，食品安全方面新出现的病原体等的快速检测等提供了新的技术平台，应该受到更多重视。

⑶新检测系统，如阻抗检测、非标记系统等。物理学和电化学检测方法应用于疾病检测平台，建立了很多新的简单的检测系统。比如非标记检测(label free detection)，就是在检测装置的表面包被上特异性抗原或抗体，结合样本中相应的抗体或抗原，导致结合表面阻抗或者是光偏振的改变，借助相应的物理学信号反映样本中待检测标志物的存在和量。非标记检测的优势是不需要标记，使检测方法研发更加简单、快速；减少了对生物原材料的需求，将原来的双抗体（或抗原）夹心法转变成简单单一抗原抗体反应。将微流控平台中的化学发光或电化学信号，转变为数字信号，相应出现了所谓的数字免疫学方法（digital immunoassay），是微流控技术的一个发展。比如日本东京大学的 Iino 等[21]报告结合有单个生物标志物的纳米颗粒，在一个疏水的微孔阵芯片借助水油相的不混合性分离，每个孔中的信号经过CMOS影像感应器转变成数字信号，可以直接记录免疫反应液中的单个生物标志物，检测敏感度可达到 78 zM。

⑷新用途，如基因序列分析、分子检测等。斯坦福大学 Quake 博士实验室发明的微流控数字PCR 方法（microfluidic digital PCR）在基因组序列分析方面比新一代核酸序列分析仪（454，Solexa，SOLiD）有更多的优势，不需要对待检测的分子进行克隆筛选，可以对测序文库直接定量，误差小于10％[22]。

新技术和材料的发展和应用是推动疾病检测方法发展的动力，也是新一代疾病检测方法发展的方向。这些新技术应用的结果是进一步改善了检测方法的敏感性和特异性，使检测仪器进一步小型化、自动化，能更好满足快速检测和研发适合资源缺乏、条件有限地区使用的检测试剂和仪器。此外，这些新技术的相互结合、整合，也是今后疾病检测方法发展的趋势和方向。

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