蛋白质组学在胰腺癌早期诊断中的应用

苏安平 田伯乐

·综述与讲座·

蛋白质组学在胰腺癌早期诊断中的应用

苏安平 田伯乐

蛋白质组学的提出及其相关技术的发展为胰腺癌的早期诊断奠定了基础。其直接定位于蛋白质水平，从整体、动态、定量的角度研究基因功能，有助于发现用于早期临床诊断的肿瘤标志物，同时也可应用于寻找新的治疗靶标和进一步揭示胰腺癌发生、发展机制。本文就近年来蛋白质组学在胰腺癌早期诊断中的应用做一概述。

一、蛋白质组学及其相关技术

蛋白质组(proteome)的概念源于蛋白质与基因组两个词的杂合，指一个细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。蛋白质组学(proteomics)则以蛋白质组为研究对象，研究整个基因组在不同时间、空间编码的全部蛋白质的组成及其相互作用[1]。具体包括三个方面[2]：(1)蛋白质的大规模鉴定和翻译后修饰的微特征研究；(2)差异表达蛋白质组学，即对多种疾病有广泛应用前景的蛋白质表达水平的比较；(3)应用质谱技术和酵母双杂交体系研究各种蛋白质间的相互作用。其中差异表达蛋白质组学在胰腺癌早期诊断中应用广泛。

蛋白质组学研究成功与否很大程度上取决于其技术水平的高低。蛋白质组学研究主要包括三大技术：(1)蛋白质组分的分离技术；(2)蛋白质组分的鉴定技术；(3)利用蛋白质信息学进行蛋白质结构和功能的预测技术。

1．蛋白质组分的分离技术：目前，最常用的分离技术是双向凝胶电泳(2-dimensional gel electrophoresis,2-DE)技术[3-6]。2-DE技术主要用于分离细胞或组织蛋白质抽提物，构建特定细胞或组织蛋白质的二维电泳图谱，分析特定条件下蛋白质的表达水平，进行差异蛋白质组学分析。由于具有高分辨率、高重复性、微量分析和制备等优点，现已成为蛋白质组学研究中首选的分离技术[3]。除2-DE技术外，用于蛋白质组分分离的技术还有亲和层析、毛细管区带电泳、反向高效液相色谱和多维色谱等[4]。

2．蛋白质组分的鉴定技术：目前常用的鉴定技术是质谱(mass spectrometry,MS)鉴定技术。根据生物大分子离子化的方式不同，MS鉴定技术可以分为：基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)和电喷雾离子化质谱(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)。前者应用激光使生物大分子离子化，得到酶解肽段的分子量，fingerprint,从而获得蛋白质的肽质量指纹图谱(peptide massPMF)，然后应用适当的软件搜寻蛋白质组数据库，实现对蛋白质的定性鉴定。后者则通过喷射过程中的电场进行离子化，可以进行肽的测序，得出肽段的氨基酸序列，从而获得肽序列标签(peptide sequence tag, PST)[5]。根据部分氨基酸序列，结合此段氨基酸序列前后的离子质量和肽段母离子的质量，在蛋白质数据库中查寻，鉴定出相应蛋白质。MS鉴定技术还可应用于蛋白质翻译后修饰以及蛋白质相互作用等研究领域。除MALDI-TOF-MS、ESI-MS外，许多新技术也开始应用于蛋白质的鉴定及相互作用的研究，如生物传感芯片质谱(biosensor chip mass spectrometry)[6]、蛋白质芯片(protein chip)[7]、表面增强激光解吸离子化-飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)[8]、同位素标记亲和标签(isotope coded-affinity tags，ICAT)技术[9]等。

3．蛋白质组分的生物信息学：生物信息学(bioinformatics)就是利用计算机科学和网络技术来解决生物学问题。在蛋白质组学方面，蛋白质组学技术所得到的高通量的研究结果需要强大的数据处理工具支持，因此生物信息学是蛋白质组学研究中不可缺少的一部分。生物信息学可对其研究的内容进行数据分析、储存、管理、搜集和修复等处理。生物信息学在蛋白质组学研究中有两个重要应用：(1)分析和构建双向凝胶电泳图谱；(2)搜索与构建蛋白质组数据库。目前常用的数据库有PSD、SWISS-PROT、PROSITE、PDB等[7,10-11]。

二、蛋白质组学在胰腺癌早期诊断中的应用

目前，已有学者应用蛋白质组学技术从胰腺癌患者血浆、胰液和癌组织中寻找相关肿瘤标志物，为胰腺癌的早期诊断提供理论支持。

1．胰腺癌血浆蛋白质组学研究：由于血浆获取方便且成本低廉，是蛋白质组学在胰腺癌早期诊断研究中的理想样本。但是由于血浆蛋白的复杂性，蛋白质组学研究非常困难。Valerio等[12]使用MALDI-TOF-MS技术未能从胰腺癌患者血浆中鉴定出胰腺癌肿瘤特异性标志物。近年来，随着SELDI-TOF-MS等新技术的发展，血浆蛋白质组学的研究迈入一个新阶段。Honda等[13]应用表面增强激光解吸电离合并混合型四极时间飞行质谱对245例血清样本进行分析，发现了4个蛋白质峰：m/z 8766、m/z 17272、m/z 28080和m/z 14779，四者联合诊断的敏感性为97.2%，特异性为94.4%，若结合CA19-9，诊断符合率达100%。Koopmann等[14]利用SELDI-TOF-MS技术分析胰腺癌患者和正常人的血浆，鉴定出3种蛋白质：PC-A、PC-B和CA19-9。这3种蛋白质作为肿瘤特异性标志物应用于临床检测时，PC-A蛋白敏感性为83%，特异性为85%；PC-B蛋白敏感性为70%，特异性为85%；CA19-9蛋白敏感性为64%，特异性为85%。国内学者付文广等[15]采用SELDI-TOF-MS技术分析了23例胰腺癌、25例正常人和11例其他胰腺疾病(慢性胰腺炎7例、胰腺假性囊肿4例)血清标本，发现血清蛋白质指纹图谱中有44个差异表达的蛋白质，其中m/z 2732 敏感性为91.30%，特异性为68.18%；m/z 9111 敏感性为52.17%，特异性为81.82%。

2．胰腺癌胰液蛋白质组学研究：由于90%的胰腺癌为导管细胞腺癌，因此通过ERCP获取的胰液标本也富集由胰腺导管细胞所释放的癌特异性蛋白[16]，这让胰液检测成为胰腺癌早期诊断的重要手段。Rosty等[17]利用SELDI-TOF-MS技术分析来自胰腺癌和其他胰腺疾病患者的胰液，发现了一个蛋白质峰并鉴定为肝癌-小肠-胰腺/胰腺炎相关蛋白I(hepatocarcinoma-intestine-pancreas/pancretitis-associated protein I,HIP/PAP-I)，其在胰腺癌胰液中的浓度显著高于其他胰腺疾病。继而采用ELISA检测，证实HIP/PAP-I与胰腺癌密切相关，提示检测胰液中的HIP/PAP-I可能有助于胰腺癌的早期诊断。Gronborg等[18]利用2-DE和LC-MS/MS技术对3例胰腺癌患者的胰液进行分析，分别鉴定出73、61、115个蛋白质。其中，23个蛋白质同时存在于3例胰腺癌患者胰液中，并鉴定出一个新的蛋白质，因其结构与HIP/PAP-I类似，将其命名为PAP-2，这一蛋白质可能成为胰腺癌早期诊断的肿瘤标志物。Chen等[19]利用ICAT和LC-MS/MS技术分析胰腺癌患者和胰腺炎患者的胰液，鉴定出3种差异表达蛋白质：纤维蛋白原B链、血浆纤维蛋白溶解酶/血浆纤维蛋白溶解酶原、神经细胞黏附分子L1。同时，Chen等[16]还用定量蛋白质组的方法比较了胰腺癌患者和正常健康人胰液蛋白谱的差异。发现有30个差异蛋白质点均出现>2.0倍的表达差异。随后应用Western blotting对胰岛素样生长因子结合蛋白2进行进一步验证，结果表明其在胰腺癌患者的胰液和组织中表达均增高。

3．胰腺癌组织蛋白质组学研究：在胰腺癌蛋白质组研究中最常用的方法是直接检测癌组织和正常对照组织。在癌组织样本中，候选肿瘤标志物可能具有较高浓度，并且有利于MS鉴定。癌组织筛选出来的差异表达蛋白质，还可进一步发展为血浆标志物。Lu等[20]利用2-DE和MALDI-TOF-MS技术对12例胰腺癌患者癌组织和癌旁组织进行分析，成功鉴定出111种差异表达蛋白质。其中，70种蛋白质在癌组织中有较强表达(多数>2.0倍)，而在正常组织中只有41种较强表达。在70种较强表达蛋白质中，两种蛋白质(fascin和cathepsin D)通过免疫组化得到证实。最重要的是fascin在21例胰腺癌患者癌组织中13例阳性表达，而在正常胰腺组织中无一表达，且fascin的表达与胰腺癌的分化程度密切相关。Shen[21]等联合应用2-DE和MALDI-TOF-MS技术比较分析了6例胰腺癌组织、2例癌旁组织、7例胰腺炎组织和6例正常胰腺组织之间蛋白质表达谱的差异，鉴定出40种差异表达蛋白质。其中7种调节蛋白质经Western blotting和免疫组化得到确认，包括：a-烯醇酶(a-enolase)、组织蛋白酶D(cathepsin D)、钙网织蛋白(calreticulin)、galectin-1、铜锌超氧化物岐化酶(CuZnSOD)和锰超氧化物岐化酶(MnSOD)。基于30%～90%胰腺导管细胞腺癌细胞散布于成纤维细胞间质中，Shekouh等[22]利用激光捕获显微切割(1aser-capture microdissection)技术分别切取4例胰腺癌患者癌组织、2例胰腺癌患者配对癌旁组织及2例正常人胰腺组织的导管上皮细胞，并进行2-DE分离及MALDI-TOF-MS分析，结果发现9种蛋白质差异表达。其中5种在癌细胞中表达增加，4种表达减少。并鉴定出4种差异表达蛋白质：S100A6、膜连蛋白III、乳酸脱氢酶和胰蛋白酶。其中，S100A6在胰腺癌组织中特异性的高表达得到了免疫组化染色的证实，同时研究表明S100A6与胰腺癌的分期密切相关。

三、蛋白质组学的问题及应用前景

蛋白质组学已经成为生命科学领域的研究热点之一，并已形成临床蛋白质组学分支。在蛋白质组学研究策略普遍被接受的同时，也应该清醒地认识到蛋白质组学技术现阶段还不是一种完美的工具，在当前技术条件的限制下，还有一些问题等待解决。例如如何解决不同的研究方法、研究对象(血浆、胰液和组织)、研究人数对实验结果的影响；如何解决高丰度蛋白对低丰度蛋白的掩盖；如何提高实验数据的重复性[23]。要解决上述问题，对胰腺癌蛋白质组学的研究应考虑以下几方面：(1)是否有足够的研究人数；(2)是否根据WHO的标准对胰腺癌进行组织学分类，是否对非肿瘤组织样本进行组织学描述；(3)是否根据年龄、性别和相关疾病选择对照组；(4)如何识别蛋白峰；(5)是否通过ELISA、Western blotting或免疫组化对差异表达蛋白质进行鉴定验证。尽管目前存在许多困难，但是随着技术与方法的不断创新与发展，蛋白质组学必将在胰腺癌的早期诊断中发挥越来越重要的作用。

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2010-04-12)

(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.02.027

610041 四川成都，四川大学华西医院肝胆胰外科

田伯乐，Email：bo-le@medmail.com.cn