胰腺癌干细胞研究进展

杜志勇 韩宝三 彭承宏

·综述与讲座·

胰腺癌干细胞研究进展

杜志勇 韩宝三 彭承宏

胰腺癌是一种恶性程度极高，预后极差的肿瘤，手术切除率低且术后容易复发和转移，并且对放、化疗不敏感。目前，人们在肿瘤的研究中提出了肿瘤干细胞理论。该理论认为，肿瘤内部存在一小部分具有干细胞特性的细胞，即肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)，它具备无限增殖、多向分化、自我更新和极强的成瘤能力，形成肿瘤并维持肿瘤的生长，且对常规的放化疗更不敏感，还可能是肿瘤转移、复发的根源。该理论首先在血液系统肿瘤的研究中获得突破[1]。在实体瘤中，目前已经在包括胰腺癌在内的多种肿瘤中分离出了相应的CSCs[2-3]。本文就胰腺癌干细胞(PCSCs)的相关研究进展综述如下。

一、PCSCs的表型

2007年，两个不同的研究小组分别报道了不同表型的PCSCs。Li等[4]将新鲜人胰腺癌标本种植于非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠皮下进行胰腺癌实质细胞的纯化和扩增，再采用荧光激活细胞分选技术发现胰腺癌中存在0.2%～0.8%的CD44+CD24+ESA+细胞，该亚群细胞在NOD/SCID小鼠体内表现出高成瘤性，连续传代成瘤实验发现其致瘤能力及在胰腺癌细胞中的比例保持不变，组织学发现其形成的肿瘤和原发肿瘤类似，两者的胰腺癌分化标志物SLOOP和stratifin也有相同的表达模式。这说明该亚群细胞具有极强的自我更新和分化能力，而且其高表达与干细胞自我更新密切相关的Shh和多梳基因家族Bmi-1，因此该亚群细胞被认为是PCSCs。Hermann等[5]从人胰腺癌组织和人胰腺癌细胞系L3.6pl中分选出CD133+细胞，发现其具备高成瘤、自我更新和多向分化特性。流式分析术发现CD133+细胞约占人胰腺癌组织中癌细胞总数的1%～3%，在大多数人胰腺癌细胞系中其含量低于1%，并发现CD133+细胞与CD44+CD24+ESA+细胞之间存在14%的重叠。他们认为，CD133+细胞可能是另一种表型的PCSCs。这一结果验证了Olempska等[6]的推论，他们检测了5株人胰腺癌细胞株CSCs标志物的表达，分析认为CD133和(或)ABCG2阳性可能代表PCSCs。最近，Rasheed等[7]报道，ALDH+胰腺癌细胞可能是另一种表型的PCSCs。这种表型的胰腺癌细胞在体外克隆形成能力和体内成瘤能力是未分选胰腺癌细胞和ALDH-细胞的5～11倍，其与CD44+CD24+细胞之间仅存在极少量的重叠。进一步研究发现，ALDH+CD44+CD24+细胞较ALDH+和CD44+CD24+细胞致瘤能力更强，但差别无统计学意义。遗憾的是他们没有研究ALDH+与CD133+细胞之间的关系。上述研究结果提示，根据目前CSCs的鉴别手段和判定标准，胰腺癌中可能存在不同表型的CSCs。

二、PCSCs与胰腺癌转移

2005年Saur等[8]报道，趋化因子受体4(CXCR4)的表达可显著增加胰腺癌肝、肺转移，AMD3100可阻止其转移潜能。Hermann等[5]发现，虽然CD133+CXCR4-和CD133+CXCR4+胰腺癌细胞都能在无胸腺小鼠体内形成原发病灶，但只有CD133+CXCR4+细胞能形成转移灶，去除这部分细胞，胰腺癌的转移特性被废除，给予CXCR4抑制剂AMD3100其转移能力也大大降低。他们还发现，CD133+CXCR4+亚群所占比例越大，胰腺癌越容易发生转移。因此，这部分细胞被认为是迁移性胰腺癌干细胞(mPCSCs)。最新研究表明[7]，ALDH+表型PCSCs可能富含mPCSCs。ALDH+和CD44+CD24+细胞之间的成瘤能力差异不大，但在迁移能力方面则表现出不同的生物学特性。ALDH+细胞在体外的迁移和侵袭能力是未分选胰腺癌细胞的3倍，CD44+CD24+细胞仅表现出轻微增加。ALDH+CD44+CD24+胰腺癌细胞更具侵袭性。临床研究也证实[7]，胰腺癌转移灶中ALDH表达率更高，原发灶ALDH表达阳性者更容易发生淋巴结和远处脏器如肝、肺的转移。抑制Shh Hegerhog信号途径可以清除ALDH+PCSCs，从而使胰腺癌在体内的侵袭和转移能力下降[9]。目前尚需进一步研究ALDH+与CD133+CXCR4+细胞之间的关系。

三、PCSCs与治疗抵抗

CSCs通常具备以下特征[3,10-11]：多处于G0期；具有抗凋亡活性；具备强大的DNA修复能力；高表达耐药蛋白；某些信号途径如Wnt/β-catenin、Notch等的激活等。因此，CSCs更加耐受常规治疗，PCSCs也不例外。研究表明[5-6,12]，不论是CD133+还是CD44+CD24+ESA+表型的PCSCs，都能耐受放、化疗。胰腺癌细胞系在体外接受健择干预后，CD133+和CD44+细胞含量显著增加[5,13]。放射治疗和健择化疗都能显著富集荷瘤鼠CD133+、CD44+CD24+ESA+和ALDH+细胞[5,12]。我们的研究也显示[14]，放化疗抵抗的胰腺癌细胞系干细胞标志物Oct-4、ABCG2表达增加，体外克隆形成能力增强，在无胸腺小鼠皮下成瘤能力也更强；放化疗抵抗的胰腺癌细胞系SW1990中CD24表达增加，说明治疗抵抗的胰腺癌细胞中富含PCSCs。深入研究PCSCs耐受放化疗的机制将有助于发掘出针对PCSCs的治疗手段。

四、PCSCs与上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)

所谓EMT，是指上皮表型细胞在特定生理和病理情况下向间充质表型细胞转化的现象，几个与胚胎发育相关的转录因子Snail、Slug和Twist等通过抑制E-cad的转录在EMT的诱导中发挥关键作用[15-16]。

EMT与胰腺癌的侵袭转移密切相关[17]。最近研究表明[7]，ALDH的表达与人胰腺癌淋巴结、肝和肺的转移密切相关，而ALDH+胰腺癌细胞同时具备干细胞特征和间质表型特征。与未分选细胞比，CDH1(其编码产物即E-cad)基因在ALDH+细胞中表达下降一半，在ALDH+CD44+CD24+细胞中下降90%；Slug在ALDH+细胞中表达增加51倍,而在ALDH+CD44+CD24+细胞中增加73倍。在EMT的诱导中起重要作用的转录因子ZEB1对CSCs“干性”的维持起重要作用。研究表明[18]，ZEB1敲除后可导致胰腺癌细胞球囊形成能力和成瘤能力下降，侵袭和转移能力也下降，还导致胰腺癌细胞对化疗药物更敏感，干细胞因子Sox2、Bmi1和p63表达下调，稳定敲除后CD24mRNA表达下调。ZEB1可能通过对微小RNA(miRNAs)的调控来实现对CSCs“干性”的维持。某些miRNAs也参与CSCs“干性”的调控，下调其中起抑制“干性”作用的miRNAs的表达即可以维持干细胞表型。miR-200家族成员(miR-141,miR-200a、b、c和miR-429)的靶基因包括维持胚胎干细胞表型的分子，如Sox2、KLF4和Bmi1，因此，其可诱导细胞分化。它们还可以通过抑制ZEB1/2mRNA的转录来抑制EMT的发生，而ZEB1也可以抑制miR-200家族成员的表达，它们之间相互作用形成一个负反馈环。因此，ZEB1可通过抑制miR-200家族成员的表达而在维持“干性”中发挥重要作用。此外，ZEB1还可以通过抑制另一个重要的“干性”抑制因子miR-203的表达来维持胰腺癌和结肠癌细胞的肿瘤起始能力，并促进mPCSC的生成。

EMT还与胰腺癌治疗抵抗有关。Wellner、Shah、Wang等[19-21]发现健择耐受的多株胰腺癌细胞系发生了EMT。我们的研究也发现[22]，放化疗抵抗的胰腺癌细胞系富含干细胞样癌细胞，同时其也发生了EMT。有研究表明，健择耐受的胰腺癌细胞系发生EMT与Notch通路的激活有关[20]，而Notch通路是重要的干细胞信号通路之一。治疗抵抗诱导的EMT与PCSCs之间可能存在密切而复杂的关系。一方面，某些表型的PCSCs本身即可能表现为间质表型,并且PCSCs可能具备更强的EMT和MET相互转化的可塑性。如Kabashima等[23]发现，胰腺癌细胞系来源的侧群(SP)细胞具备更强的EMT和MET相互转化的可塑性。SP细胞被认为是具有干细胞特性的一类细胞。另一方面，在治疗选择压力下，CSCs自我更新受到抑制，放化疗富集PCSCs可能不仅仅是简单的通过杀死敏感的癌细胞来实现，治疗抵抗诱导的EMT可能促进了PCSCs和mPCSCs的产生,分化相对成熟的癌细胞和PCSCs可能通过EMT和MET过程达到动态平衡。两个独立的研究小组在乳腺癌的研究中发现[24-25]，乳腺癌细胞在经历EMT后获得了与干细胞类似的特征，他们认为诱导EMT促进了乳腺癌干细胞的产生。Vesuna等[26]的最新研究表明，与EMT密切相关的转录因子Twist可以下调CD24的表达而促使乳腺癌干细胞的生成。在胰腺癌中，治疗抵抗诱导的EMT是否促进了PCSCs和mPCSCs的生成还有待于深入研究。

五、针对PCSCs的治疗策略

在充分了解CSCs自我更新机制的基础上，选择性阻断其信号通路的关键靶点可以促使CSCs分化或诱导其凋亡，这种CSCs特异性的分化和消除治疗有望从源头上控制肿瘤的复发和转移，从而获得显著的疗效。此外，CSCs特异性表面标志也是潜在的治疗靶标。

1．针对PCSCs自我更新途径的治疗：Li等[4]发现CD44+CD24+ESA+PCSCs中存在Shh途径的激活，与正常胰腺上皮细胞相比，该表型PCSCs中Shh mRNA表达增加了46倍，而未分选的肿瘤细胞仅增加4倍。因此，针对Shh途径的治疗有可能对胰腺癌的治疗有益。转录因子神经胶质细胞瘤相关抗原-1(glioma-associated antigen-1,Gli-1)介导了Shh途径的激活，针对Gli1 mRNA的3′非编码区(3′-untranslated region,3′-UTR)可有效抑制胰腺癌细胞增殖和诱导其凋亡[27]。Feldmann等[9]发现，裸鼠移植瘤经过健择治疗后，ALDH表达明显增高，联合应用Shh抑制剂环杷明(cyclopamine)后，ALDH减少三分之二。这表明Shh途径被抑制后，PCSCs自我更新受抑制。但单独环杷明治疗并不能完全废除其致瘤性，说明PCSCs中还存在其他信号途径的激活并参与其自我更新。

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号途径对维持CSCs的自我更新是必需的。p70s6激酶是mTOR下游的靶基因，其激活被认为是该通路激活的可靠标志[28]，p70s6激酶活化后可磷酸化其下游的核糖体S6蛋白(s6 ribosomal protein,s6rp)。Mueller等[29]分析胰腺癌组织中s6rp的磷酸化状态，发现包括CD133+PCSCs在内的少部分胰腺癌细胞中mTOR途径激活。于是他们应用Shh途径抑制剂(环杷明/CUR199691)和mTOR阻断剂雷帕霉素及健择治疗胰腺癌。结果显示三联治疗可在体内外清除CD133+和CD24+CD44+ESA+细胞，还可以清除SP细胞，并且荷瘤鼠可以耐受三药联用，其生存期显著延长。而单独应用环杷明或雷帕霉素或加健择虽然都可以导致CD133下降，但都不足以清除PCSCs。此外，他们还发现三联治疗还可以针对mPCSCs。单独给予健择或雷帕霉素或二者联用都不能显著减少胰腺癌细胞的迁移性，单独使用环杷明虽然可以显著降低其迁移能力，但必须和健择联用才能完全废除其迁移性。流式分析术发现，给予健择后同样导致CD133+CXCR4+mPCSCs富集，而只有环杷明和健择联用或三联治疗才能完全清除CD133+CXCR4+亚群。体内实验表明，健择预处理过的胰腺癌细胞在免疫缺陷小鼠体内表现出明显的转移，而环杷明预处理的细胞转移减少。健择和环杷明二联预处理进一步减少，三联处理后不能成瘤及发生转移。

2．针对某些miRNAs的治疗：受p53调控的miR-34，其靶蛋白是Notch通路蛋白和Bcl-2，它在CSCs的维持和生存中也可能起作用。Ji等[30]发现，p53突变的人胰腺癌细胞系MiaPaCa2来源的CD44+/CD133+细胞高表达Notch/Bcl-2，而miR-34表达缺失。重建miR-34的表达不仅可以下调胰腺癌细胞中Bcl-2和Notch1/2的表达，还诱导其凋亡和细胞周期阻滞，增强化、放疗敏感性，并显著抑制肿瘤的克隆形成和侵袭，其致瘤性也显著下降，流式分析术检测发现CD44+/CD133+细胞减少87%。该结果显示miR-34可能通过下调Bcl-2和Notch而在PCSCs的自我更新和(或)细胞命运决定中起重要作用。因此，对于缺乏p53-miR34的胰腺癌重建miR-34的表达可能具有重要意义。另外，针对ZEB1-miR-200反馈环的治疗对胰腺癌而言可能是有效的治疗途径[19]。

3．针对PCSCs表面标志物的的靶向性治疗：Salnikov等[31]应用针对PCSCs标志物——上皮黏附分子(EpCAM)的双特异性抗体EpCAMxCD3 能明显地延缓胰腺癌细胞株BxPC3移植瘤在SCID鼠上的生长。提示针对PCSCs表面标志物的靶向性治疗也是值得进一步研究的内容。

4．针对EMT-PCSCs的治疗：由于PCSCs本身即可能表现为间质表型，且分化相对成熟的癌细胞和PCSCs可能通过EMT和MET过程相互转化，因此发现与CSCs和EMT相关的分子信息有助于开发新的针对CSCs和EMT的药物，逆转其间质表型将有助于增强其对传统治疗的敏感性[32-33]。

此外，胰腺癌富含基质成分，且处于低氧状态，间质成分和低氧微环境都参与了胰腺癌的放化疗耐受。并且低氧可以富集CSCs，并促进CSCs“干性”的维持和阻止其分化。因此，肿瘤微环境尤其是低氧微环境对PCSCs及治疗的影响也值得进一步深入研究。

六、PCSCs标志物对胰腺癌复发和预后的判断

Maeda等[34]发现，CD133的表达与人胰腺癌淋巴结转移及预后差有关。Welsch等[35]认为，CD133和CXCR4的表达与肿瘤复发无关。Rasheed等[7]研究发现，胰腺癌原发病灶ALDH的表达与肿瘤大于3 cm、肿瘤分化程度低及淋巴结转移相关，因此，原发灶ALDH表达阳性的患者预后更差，与原发灶ALDH表达阴性的患者相比，其中位生存期下降22%(14个月对18个月)。Hong等[13]的结果表明，胰腺癌CD44阳性提示预后差，CD44阳性者中位生存期短于CD44阴性者(16.9个月对25.3个月)。不同表型PCSCs对肿瘤复发及预后的影响可能不同，不同的PCSCs标志物对预后及复发的判断价值也可能存在差异，因此还需要做大量前瞻性研究。

总之，深入了解PCSCs生物学行为及相关的分子调控途径，将促进对胰腺癌侵袭、转移及耐受常规治疗的研究，为胰腺癌的治疗带来新的策略。

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2010-05-05)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.02.025

中国博士后基金(20090450702)；上海市科委博士后基金(09R21415100)

200025 上海，上海交通大学附属瑞金医院消化外科研究所

彭承宏，Email：chhpeng@188.com