高效液相色谱法测定冬虫夏草口服液中腺苷

许 勇， 王 柯， 季 申

(上海市食品药品检验所，上海201203)

冬虫夏草口服液其处方由冬虫夏草单方组成，具有补肾益肺、秘精益气等功能。其主要活性成分之一腺苷是一种内源性嘌呤核苷，具有舒张血管、降低血压、抑制血小板聚集、松弛血管平滑肌、镇静和抗惊厥等多种生理活性［1］。为控制药品质量，保证临床用药的安全性和有效性，我们建立了用高效液相色谱法对制剂中冬虫夏草的活性成分腺苷进行了测定。冬虫夏草及其制剂中腺苷的测定方法文献报道的主要为高效液相色谱法［2-4］。如其中冬虫夏草药材中腺苷的主要提取方法为用有机试剂超声或回流提取后蒸干，溶剂定容后，利用高效液相色谱仪进样分析。而冬虫夏草口服液文献报道的提取方法为用水、乙醚、水饱和的正丁醇依次萃取，正丁醇液蒸干，溶剂定容后，利用高效液相色谱仪进样分析。方法均较为繁琐、费时。而笔者是利用了口服液制剂中易干扰测定的多糖量较高，而多糖在被醇沉后，高速离心下容易沉淀的特点，建立了醇沉后离心的简单易行的前处理方法，该方法准确、专属性强，可有效地控制本品的质量。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器(美国Agilent公司);Sartorius BS2202/CP225D型电子天平(德国Sartorius公司);腺苷对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号879-200001);冬虫夏草口服液(中华御医堂养生文化研究院有限公司与上海御医堂保健科技有限公司提供，批号 20080117、20080114、20080226);甲醇、乙腈均为色谱纯(MERCK公司)，试剂均为分析纯［中国医药(集团)上海化学试剂公司］。

2 方法与结果

2.1 检测波长的选择

取腺苷对照品溶液在200～400 nm进行紫外扫描，由光谱图可见，腺苷对照品在260 nm波长处有最大吸收，故选择260 nm作为检测波长。

2.2 色谱条件与系统适应性试验

色谱柱 Thermo ODS-HYPERSIL(0.46 cm ×20 cm，5 μm)色谱柱;流动相甲醇－0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(15∶85);体积流量1.0 mL/min;柱温30℃;检测波长:260 nm;进样量10 μL。理论板数按腺苷峰计算应不低于5 000。

2.3 溶液的配制

2.3.1 对照品溶液的制备 取腺苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含30 μg的溶液，即得。

2.3.2 供试品溶液的制备 精密量取本品5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇3 mL，摇匀，放冷后，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。

2.3.3 阴性对照溶液的制备 取缺冬虫夏草的样品按制备工艺制备冬虫夏草口服液，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2.4 方法专属性考察

按上述色谱条件分别对对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液进行分析，结果无干扰。见图1。

图1 腺苷的高效液相色谱图

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 精密称取腺苷对照品适量，加50%甲醇制成浓度分别为0.362 5 mg/mL的对照品溶液⑴与浓度为36.25 μg/mL的对照品溶液⑵。分别精密吸取对照品溶液⑴2、5、10 μL 和对照品溶液⑵1、2、5、10 μL 注入液相色谱仪，记录峰面积。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行回归分析。结果表明，腺苷在0.036 25 ～3.625 μg范围内与峰面积值线性关系良好，回归方程为:Y=3 093X+22.74，r=0.999。

2.5.2 精密度试验 精密吸取36.25 μg/mL的腺苷对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积，腺苷峰面积RSD值分别为0.11%，表明测定精密度良好。

2.5.3 重复性试验 取同一冬虫夏草口服液样品(批号:20080117)，各一式6份，按2.3.2项下的方法分别制备供试品溶液，进样测定。计算其RSD值为0.50%，表明测定重复性良好。

2.5.4 稳定性试验 将供试品溶液(批号:20080117)于室温下放置 0、4、6、9、18、24 h，进样测定。计算得腺苷的峰面积的RSD值为1.5%，表明供试品溶液在24 h内化学性质稳定。

2.5.5 回收率试验 精密量取已知量的样品(批号:20080117)2.5 mL，一式9份，置10 mL量瓶中，以3份为1组，分别精密加入腺苷对照品溶液适量，制备供试品溶液，按色谱条件项下测定，计算平均回收率为101.4%，(RSD=0.91%)。

2.5.6 样品测定 取 3样品，批号分别为 20080117、20080114、20080226，分别按 2.3.2 项下的方法制备供试品溶液，进样测定，以外标法计算质量浓度，结果分别为55、56、56 μg/mL。

3 讨论

3.1 流动相的考察

对①甲醇-水(15∶85);②乙腈－0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(7∶93)和③甲醇－0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(15∶85)3个流动相系统进行了考察。经试验，流动相系统①得到的对照品色谱图中，色谱峰脱尾严重，对称性较差;流动相系统②得到的供试品色谱图中，腺苷色谱峰虽然对称性较好，但与其他色谱峰的分离度较差，没有达到基线分离;流动相系统③得到的供试品色谱图中，腺苷色谱峰较对称，且与其他色谱峰均分离良好，故选择流动相③用于检测。

3.2 沉淀溶剂的选择

冬虫夏草口服液中含有大量的多糖，为了消除多糖对腺苷测定的影响，考虑用有机溶剂沉淀的方法。为有效对样品进行净化，对沉淀溶剂进行了考察，试验中曾经选择用乙醇和甲醇两种有机试剂对糖进行沉淀。精密量取本品5 mL，置10 mL量瓶中，一式4份，以二份为一组，一组加甲醇稀释至刻度，另一组加乙醇稀释至刻度，分别摇匀，离心，取上清液进样分析，结果(见表1)表明，乙醇在沉淀糖与杂质的时候，也将部分腺苷吸附下来，为保证净化时不影响提取效率，最终选用甲醇作为沉淀溶剂。

表1 沉淀溶剂的考察

3.3 沉淀试剂加入量的选择

为达到净化效率最高且不影响提取效率，对净化溶剂甲醇的加入量进行了考察，分别对样品与甲醇的比例为7∶3;1∶1;1∶4，3种比例进行了考察。精密量取本品2、5、7 mL，分别置10mL量瓶中，一式两份，分别加甲醇至刻度，摇匀，离心，取上清液进样分析，结果(见表2)表明，样品与甲醇比例为1∶1时，能有效去除杂质，且不影响腺苷被提出，故选择精密量取样品5 mL，加甲醇5 mL的净化方法。

表2 甲醇加入量的考察

4 结论

冬虫夏草药材中腺苷的测定方法中国药典2010年版一部也有收载［5］，本法与药典的方法相比较，药典是采用磷酸盐缓冲溶液(pH6.5)［取0.01 mol/L磷酸二氢钠68.5 mL与0.01 mol/L 磷酸氢二钠31.5 mL，混合(pH 6.5)］-甲醇(17∶3)作为流动相系统，流动相的配制方法较为繁琐、费时，而本法的流动相是采用甲醇－0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(15∶85)，配制方法较为简便。且在前处理上，利用了口服液制剂多糖的特点，醇沉离心后直接进样，使方法更加简单易行。

［1］方和桂，康 洪.HPLC测定金水宝胶囊中腺苷的含量［J］.中国现代应用药学杂志，2008，25(3):243-244.

［2］黄红兵，江英桥.虫草口服液的质量标准研究［J］.中成药，1999，21(5):228-230.

［3］张振谦，马月飞，黄永春.虫草腺苷含量的快速测定［J］.广西工学院学报，2007，18(3):4-7.

［4］夏文娟，曾晓英，袁海龙，等.不同产地冬虫夏草腺苷含量测定［J］.中国中药杂志，2001，26(8):540-542.

［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:106.