大孔吸附树脂纯化蒺藜中总皂苷工艺的优化

彭 亮， 李知敏， 祝珍芳

(江西科技师范学院药学院，江西南昌330013)

1 引言

蒺藜为蒺藜科蒺藜属植物Tribulus terrestris L.的干燥成熟果实，别名刺蒺藜、硬蒺藜、白蒺藜，其果实始载于《神农本草经》，列为上品，功能“平肝解郁，活血祛风，明目，止痒，头痛眩晕，胸肋胀痛，乳闭乳痈，目赤翳障，风疹瘙痒”。蒺藜化学成分的研究始于20世纪60年代，目前认为其主要成分有多糖类、生物碱、黄酮类、皂苷类和氨基酸等化合物［1］。现代药理学实验证明，蒺藜中的总皂苷类物质具有抗癌、抗衰老、保护心脑血管、调节血糖、血脂和性强壮的作用［2-6］。

目前蒺藜皂苷在现代医学和药学中的研究运用越来越广泛，而大孔吸附树脂的优点决定了它在皂苷成分的分离纯化中具有广泛的应用前景。本实验采用大孔吸附树脂对蒺藜中的总皂苷进行分离纯化，并对分离纯化工艺进行了优化。

2 实验方法及内容

2.1 试剂及仪器

试剂:菝葜皂苷元标准品(购自中国药品生物制品检定所，110744-200509);蒺藜药材(江西省中药研究院提供);AB-8、D101和HPD-450大孔吸附树脂购自沧州宝恩化工公司;其余试剂均为分析纯。

仪器:UV-2600型紫外-可见分光光度计(上海尤尼科);RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣);BS224S型电子天平(赛多利斯)。

2.2 实验方法

2.2.1 蒺藜皂苷的提取 取100g蒺藜药材用70%乙醇(1∶10)于80℃水浴中提取2次，每次2 h。合并提取液，减压浓缩。搅拌下将上述浓缩液中加入适宜乙醇，静置2 h，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，转至量瓶，加蒸馏水定容至刻度，作为实验母液，实验时根据需要稀释至相应体积。

2.2.2 大孔吸附的预处理 95%乙醇浸泡大孔吸附树脂24 h，湿法装柱后，蒸馏水洗至无醇味，用5%HCl浸泡2 h，用蒸馏水洗至中性;再用5%NaOH浸泡2 h，用蒸馏水洗至中性;最后用95%乙醇冲洗，直至流出液澄清，且蒸干后无残留物，最后用蒸馏水洗至无乙醇味即可。

2.2.3 标准曲线的制备［7］精密称取菝葜皂苷元对照品14.40 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容即得对照品溶液。精密吸取对照品溶液0.8、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于三角瓶中，置水浴中挥干甲醇，各加10 mL高氯酸，在25℃水浴加热显色30 min后，取出，摇匀，置冰水浴中15 min，使反应停止，以甲醇同法制备空白，在310 nm处测定吸收值。以吸收值A为横坐标，菝葜皂苷元对照品质量(mg)为纵坐标，绘制标准曲线。

2.2.4 皂苷的测定 取1 mL待测液，按照2.2.3项所述方法显色后于310 nm下，以未加显色剂的待测液为空白，用分光光度计测定其吸光度。由标准曲线所得回归方程计算出待测液中总皂苷。

2.2.5 3种树脂对蒺藜皂苷吸附量的测定 准确称取经2.2.2项方法处理，并干燥的3种大孔吸附树脂各1.0 g，置于磨口具塞三角瓶中，精确加入上柱样品20 mL，密封后，于25℃放置24 h。待蒺藜皂苷被树脂充分吸附后，过滤，测定滤液中总皂苷的浓度。按下面的公式计算对总皂苷的吸附量(mg/g)

其中:Q:吸附量(mg/g);Co:上柱液初始总皂苷浓度(mg/mL);C:滤液中总皂苷浓度(mg/mL);V:加入上柱液体积(mL);W:大孔吸附树脂质量(g)。

2.2.6 蒺藜总皂苷解吸率的测定 将2.2.5项中过滤后得到的大孔吸附树脂置于磨口具塞三角瓶中，再加入50 mL 95%的乙醇溶液，25℃放置2 h，使总皂苷解吸附，过滤后测定滤液中的总皂苷，按照下面的公式计算总皂苷的解吸率。

其中:D:解吸率(%);C:滤液中皂苷量(mg/mL);V:所加乙醇的体积(mL);Q:树脂吸附皂苷的量(mg/g);W:大孔吸附树脂的质量(g)。

2.2.7 上柱液皂苷浓度对吸附效果的影响 取2.2.1项中制备的实验母液，配制皂苷浓度为0.276、0.323、0.369、0.420、0.461 mg/mL的上样液。对预处理过的D101型树脂进行湿法装柱，分别取 40、34.3、30、26.7、24 mL 的上述上样液(即保证上样的总皂苷量均为11.056 1 mg)进行动态吸附，待吸附平衡后，先用蒸馏水冲洗后，再用70%乙醇洗脱，收集流出液，定容至相同体积后，测定皂苷。

2.2.8 最大上样量的考察 对预处理过的大孔吸附树脂进行湿法装柱，用选定浓度的样品液进行动态吸附，每1BV收集洗脱液，测定其中总皂苷。

2.2.9 pH值对皂苷吸附效果的影响 对预处理过的大孔吸附树脂进行湿法装柱，取30 mL选定浓度的样品液(含总皂苷11.06 mg)6 份，将 pH 分别调整为 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0，进行动态吸附，待吸附平衡后，先用蒸馏水冲洗后，再用70%乙醇洗脱，收集洗脱液，并定容至相同体积后，测定总皂苷。

2.2.10 乙醇浓度对洗脱效果的影响 对预处理过的大孔吸附树脂进行湿法装柱，取40 mL选定浓度的样品液(含皂苷14.75 mg)4份调整至适当的pH，分别进行动态吸附，待吸附平衡后，先用蒸馏水冲洗，然后分别采用30%、50%、70%、90%乙醇进行洗脱，每1BV收集洗脱液，测定其中总皂苷。

3 实验结果

3.1 标准曲线

以菝葜皂苷元对照品的质量为纵坐标，吸光值为横坐标，做标准曲线，得菝葜标准品质量M(mg)与吸光值(A)的方程:M=0.980 3A-0.004 9(相关系数r=0.999 1)。菝葜皂苷元在0.230～0.720 mg间具有良好的线性范围。

3.2 3种树脂对蒺藜总皂苷的吸附与解析实验

吸附量和解吸率是大孔吸附树脂在提取和分离天然产物时需要考虑的重要参数，它不仅要求树脂对目标物质具有较高的吸附量，同时还应该具备较高的解吸。

3.2.1 吸附量的实验结果 表1列出了AB-8型、D101型、HPD-450型3种大孔吸附树脂对蒺藜皂苷的吸附量。由表中数据可知，3种型号的吸附树脂对蒺藜皂苷的吸附能力都比较强，吸附率均超过了70%。其中D101型的吸附力最强，吸附率达到83.1%，而AB-8型和HPD-450型的吸附能力相当。

3.2.2 解吸率的实验结果 表2列出了AB-8型、D101型、HPD450型3种大孔吸附树脂对蒺藜皂苷的解吸率。由表中数据可知，在95%的乙醇溶液中，3种型号的吸附树脂对蒺藜皂苷的解吸附能力都比较强，解吸率均超过了70%。其中D101型的解吸附能力最强，解吸率达到91.96%。

表1 3种树脂的皂苷吸附量(n=5)

表2 3种树脂的解吸率(n=5)

通过分析表1和表2，综合考虑吸附量和解吸率，在对蒺藜皂苷纯化过程中，D101型吸附树脂较AB-8型和HPD-450型吸附树脂理想，因此，在以后的实验中采用D101型大孔吸附树脂对蒺藜总皂苷进行分离。

3.3 D101树脂分离蒺藜总皂苷的工艺优化

3.3.1 上柱液皂苷浓度对吸附的影响 用5份不同皂苷浓度，但具有相同皂苷质量的上柱样品，考察皂苷浓度对D101型树脂吸附效果的影响，结果如图1所示。

图1 上柱液皂苷浓度对吸附的影响曲线

由图1可以看出，随着上样液中皂苷浓度的增加，洗脱液中的皂苷量呈先增加后减少的趋势，在浓度为0.369 mg/mL时，洗脱液中的皂苷量最高。当溶液中总皂苷质量一定的情况下，皂苷浓度越低，所需的上样体积越大，因此未充分吸附而随上样液流出的皂苷量也较大，导致被吸附的皂苷较少。而皂苷浓度较大时，皂苷分子之间竞争大孔吸附树脂的吸附位点比较剧烈，导致溶液中的皂苷不容易与大孔吸附树脂发生吸附，从而有较多的皂苷随上样液流出柱外。因此，在以后的实验中，将上样液的皂苷浓度调至0.369 mg/mL。

3.3.2 最大上样量的考察 用皂苷浓度为0.369 mg/mL的上柱样品对D101型大孔树脂进行最大上样量的考察。流出液中皂苷量与上样液体积的关系如图2所示(每BV上样液含皂苷5.532 mg)。

由图2可知，随着上样液体积的增加，流出液中皂苷量也逐渐增大。当上柱液体积小于6BV时，皂苷的泄露量较少。而当上样液体积达到13BV时，流出液中的皂苷量与上样液中的皂苷量接近，说明此时树脂的吸附趋于饱和。为了减少皂苷的损失，上样液的体积选为5BV。

图2 D101动态吸附曲线

3.3.3 pH值对吸附的影响 取皂苷浓度为0.369 mg/mL的上柱液30mL(皂苷量11.06 mg)，调pH 为3.5、4.0、4.5、5.0、6.5和6.0，进行动态吸附，先用蒸馏水冲洗，再用70%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，定容至相同体积后测定皂苷，结果见图3。

图3 pH值对D101大孔吸附树脂吸附量的影响

由图3可知，pH值对D101吸附蒺藜皂苷的影响较大，随着pH的增大，吸附效果呈先升高后下降的趋势，当上样液pH为5.0～5.5时，吸附效果最好。因此，在以后的实验中，将上柱液的pH值调至5.0～5.5。

3.3.4 乙醇浓度对洗脱效果的影响 用皂苷浓度为0.369 mg/mL，pH为5.0～5.5的上柱样品40 mL进行动态吸附(总皂苷为14.75 mg)，分别用30%、50%、70%、90%的乙醇溶液进行洗脱，洗脱液每1BV进行收集，结果如图4所示。

图4 不同浓度的乙醇溶液对D101树脂中总皂苷分离效果的影响

由图4可知，4种乙醇浓度的洗脱液洗脱6BV时，30%的乙醇洗脱率较低，仅有55.53%，而50%、70%和90%的洗脱率分别为81.34%、83.67%和83.25%，三者相差不大，而且70%和90%乙醇的洗脱情况非常相似，两条洗脱曲线几乎重叠。但是70%和90%的乙醇溶液洗脱峰在1～3BV时较尖锐，说明皂苷洗脱比较集中，在洗脱液体积为3BV时，洗脱率已达74.20%和74.84%，而50%乙醇此时的洗脱率仅为62.80%，而洗脱液的用量越大，带入杂质的几率也就越大，同时为了降低成本，今后的实验中洗脱液浓度选用70%的乙醇，洗脱液体积为3BV。

3.3.5 最优工艺验证 选用D101大孔吸附树脂，调整上柱液质量浓度0.369 mg/mL，pH值5.0～5.5，上样体积5BV。用70%的乙醇作为洗脱剂，洗脱液体积3BV，测定洗脱液中蒺藜总皂苷的量为27.380 mg。将洗脱液干燥后称定质量，计算干燥品中的总皂苷量为81.44%。

4 讨论

大孔吸附树脂是一种具有多孔立体结构人工合聚合物吸附剂，具有较好的吸附性能，物理化学稳定性高、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、操作简便、成本较低、可反复使用等优点。几年来，大孔吸附树脂在总黄酮、总皂苷、总生物碱等天然药物有效部位的分离纯化过程应用越来越广泛［8-12］。

实验中，通过对AB-8、D101和HPD-450三种大孔吸附树脂对蒺藜总皂苷的静态吸附量和解吸率的考察，确定D101型大孔吸附树脂较适合用于蒺藜总皂苷的分离纯化，其分离纯化工艺的最佳参数为:上柱液质量浓度0.369 mg/mL，pH值5.0～5.5，上样体积5BV。用70%的乙醇作为洗脱剂，洗脱体积3BV，洗脱率可达70%以上。此时，分离产品中的总皂苷可达80%以上。

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