NADPH氧化酶p22phox亚基C242T基因多态性与糖尿病患者颈总动脉粥样硬化相关性研究

金光明，朴莲善，李 兰

（延边大学附属医院，吉林 延吉 133000）

糖尿病是由多种病因引起的以血糖升高为特征的代谢性疾病。随着社会经济的发展及人们生活水平的提高，糖尿病的发病率呈逐年上升趋势。据研究表明，糖尿病患者并发心血管疾病的系数比正常人高2～4倍[1]，颈总动脉内-中膜厚度（IMT）是冠心病、脑血管疾病的预测因子，是糖尿病患者动脉硬化的定量临床指标[2-3]。目前，使用彩色多普勒超声技术通过对颈总动脉IMT的测量以及颈总动脉壁粥样硬化斑块的检测，是预测和定量评价颈总动脉疾病的重要手段。近年来发现NADPH氧化酶是活性氧ROS生成的关键部位，其中氧化酶p22phox亚基与酶活性相关，是NADPH氧化酶生成氧自由基的关键部位，而其中位于4号外显子上的第242密码子存在C-T基因突变，最终影响血管自由基的生成，成为心、脑血管病变的病因之一。本文主要研究2型糖尿病患者的颈总动脉IMT的改变与NADPH氧化酶p22phox亚基C242T基因多态性的联系，以阐明C-T基因突变与2型糖尿病患者颈总动脉粥样硬化的发生发展的关系，从而为临床有效防治2型糖尿病患者大血管并发症提供基因学方面的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 研究对象

选取本院住院的T2DM患者273例，其中男128例，女145例，平均年龄（55.45±10.55）岁。T2DM诊断依据1999年WHO诊断标准。所有受检对象均为无血缘关系个体。

1.1.2 仪器与检查方法

使用Siemens Acuson X300彩色多普勒超声诊断仪，探头频率5～7.5MHz。受检者平卧位，肩部垫高，颈后仰，从锁骨上窝逐渐上移并分别纵、横切扫查，于颈总动脉分叉处后方2cm处，取后壁测定颈总动脉舒张期IMT，重复测量3次取平均值。检查时宜轻，切勿加压形成人为血管狭窄，注意双侧对比。正常人的颈总动脉IMT<1mm（图1），以IMT≥1mm（图2）作为颈总动脉IMT增厚标准，以内膜局限性突出管腔厚度≥1.3mm（图 3）为斑块形成标准[4]。

图1 正常厚度的颈总动脉内-中膜的声像图。图中所示右侧颈总动脉内-中膜厚度为0.4mm。图2 颈总动脉内-中膜增厚的声像图。图中所示右侧颈总动脉内-中膜厚度为1.1mm，右侧颈总动脉管腔内径为7.3mm。图3 颈总动脉粥样硬化斑块形成的声像图。图中所示右侧颈总动脉内-中膜局限性突出管腔厚度1.7mm，提示粥样硬化斑块形成。Figure 1.Normal thickness of the intima-media in right common carotid artery is 0.4mm.Figure 2.Thickness of the intima-media in right common carotid artery is 1.1mm,the right common carotid artery lumen diameter is 7.3mm.Figure 3.Protrusion of the intima-media into the lumen of right common carotid artery is 1.7mm,suggesting that the atherosclerotic plaque was formed.

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取

采用Promega公司生产的Wizard Genomic DNA Purification Kit提取DNA。取被检测对象肘静脉血3ml到加有EDTA-Na2抗凝剂的真空采血管中，并立刻颠倒混匀。取300μl血样加入到1.5ml Eppendorf离心管中，按照细胞裂解、核裂解、RNA去除、沉淀蛋白质、析出DNA、清洗DNA、水化DNA的过程分别加入试剂，进行DNA的提取。最后将所得的DNA经紫外分光光度计定量后于－70℃保存备用。

1.2.2 聚合酶链反应

所设计引物为：上游引物：5，-TGC TTG TGG GTA AAC CAA GGC CGG TG-3’，下游引物：5，-AAC ACT GAG GTA AGT GGG GGT GGC TCC TGT-3’，由Promega公司合成。p22phox基因的PCR扩增反应体系均为50μl，其中含10×PCR 缓冲液 5μl，2.5mmol/l dNTP 4μl，上、下游引物各 2μl，模板DNA 5μl，Taq DNA聚合酶0.6μl，不足体积用灭菌双蒸水补足至50μl。置热循环仪（TC-48/H型）中94℃预变性5min；再按下列程序循环35次，即94℃变性50s，59℃退火50s，72℃延伸 50min；末次循环后，72℃延伸 5min。

1.2.3 扩增产物的限制性酶切

取 PCR扩增产物 15μl， 用 1μl限制性内切酶 RSA I（Promega公司）酶切NADPH氧化酶p22phox亚基242位点，37℃孵育4h，反应终止后，消化片段在2.5%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，染色后经紫外灯判断结果并拍照。

1.3 统计学处理

用SPSS11.5软件包进行分析。将IMT正常与IMT增厚组、无斑块组与有斑块组的样本含量进行方差齐性检验，以消除差异。基因型和等位基因频率采用基因直接计数法计算，各组间基因型及基因频率比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 NADPH氧化酶p22phox亚基基因型分析

NADPH氧化酶p22phox亚基基因PCR扩增产物片段大小为348bp，根据限制性内切酶RSA I酶切片段的情况，基因型有 3种，CC出现 348bp一条带，CT出现 348bp、160bp、188bp三条带，TT出现160bp、188bp两条带（图4）。

图4 NADPH氧化酶p22phox亚基242位点基因型。2.5%琼脂糖凝胶电泳图。M：DNA标记物；1、2为TT基因型，3、4为CT基因型，5、6为CC基因型。Figure 4.NADPH oxidase subunit p22phox gene 242 genotype.Detected by DNA 2.5%agarose gel electrophoresis.M:DNA marker;1,2:TT genotype;3,4:CT genotype;5,6:CC genotype.

2.2 IMT正常组和IMT增厚组NADPH氧化酶p22phox亚基基因多态性的比较

NADPH氧化酶p22phox亚基基因242位点基因多态性在IMT正常组和IMT增厚组中的分布存在显著性差异（χ2=10.788，P<0.05）；等位基因频率在两组人群中的分布也存在显著性差异（χ2=3.846，P<0.05）（表 1）。

表1 2组患者p22phox242位点各基因型和等位基因频率[例数（%）]

2.3 无斑块组和有斑块组NADPH氧化酶p22phox亚基基因多态性的比较

NADPH氧化酶p22phox亚基基因242位点基因多态性在无斑块组和有斑块组中的分布存在显著性差异 （χ2=12.332，P<0.05）；等位基因频率在两组人群中的分布也存在显著性差异（χ2=3.799，P<0.05）（表 2）。

表2 2组患者p22phox242各基因型和等位基因频率[例数（%）]

3 讨论

糖尿病在世界范围内已成为继心脑血管疾病、肿瘤之后严重危害人类健康的第三大慢性病。在很多情况下，糖尿病的主要危害不是糖尿病本身，而是在糖尿病发展过程中出现的各种慢性并发症。糖尿病引起的大血管病变可以导致动脉硬化、舒缩功能障碍及加重血管损伤后内皮炎性反应和血管平滑肌增殖等，造成冠心病等糖尿病性心血管疾病。虽然现代医学技术已能有效地控制大多数患者的血糖，但仍无法有效地预防和治疗糖尿病引发的慢性并发症。由于糖尿病并发症的高发性和严重性，糖尿病已经成为世界第五大致死性疾病。

颈总动脉IMT是冠心病、脑血管疾病的预测因子，是糖尿病患者动脉硬化的定量临床指标。动脉粥样硬化的危险因素年龄、高血糖、血脂异常、吸烟、高血压等只能解释颈总动脉IMT增厚的少部分，大部分与基因多态性、氧化应激、纤溶系统异常、炎症反应等有关。

NADPH氧化酶p22phox亚基是血管内皮活性氧ROS的主要发源地[5]，Ceriello等[6]又曾提出氧化应激参与糖尿病发病的关键环节。NADPH氧化酶是细胞膜上一类特殊的电子传递复合物，是由 p40phox，p47phox，p67phox，细胞色素 b558（p22phox,gp91phox）五个主要基构成[7]。细胞色素b558是NADPH的主要成分，由一条重链和一条轻链两个亚基组成。其中重链为91KD糖蛋白（gp91phox），轻链为22KD多肽（p22phox），前者是NADPH氧化酶核心部分，后者则与酶活性相关，是NADPH氧化酶生成氧自由基的关键部位[8]，其编码基因CYBA位于染色体16q24上。CYBA基因有四个多态性，即 C242T、G508A、C549T、A640G，而其中位于 4 号外显子上的第242密码子存在C-T基因突变，使得编码的72号氨基酸的组氨酸变为酪氨酸，即产生一个RSA I酶切位点。它影响NADPH氧化酶的活性，引起氧化修饰的低密度脂蛋白（O-XLDL）生成，O-XLDL可抑制血管内皮细胞，O-XLDL受体和清道夫受体结合，引起细胞凋亡，还可抑制一氧化氮合成酶，引起一氧化氮合成下降，使血管收缩，血小板聚集，血栓形成，成为心、脑血管病因之一[9]。组氨酸变为酪氨酸，这一位点被认为是p22pho亚基结合血红蛋白的部位，而血红蛋白也是体内参与超氧阴离子生成重要部分，每分子氧合血红蛋白分解释放一个超氧阴离子，因而这种突变也间接影响了血管内皮活性氧ROS产生。

观察IMT的增厚及斑块是否形成，目前最为常用的一种无创性检查就是彩色多普勒超声检查技术。它对于评价病变程度，对并发症的早期发现、早期治疗及预后具有重要价值。现阶段国内外学者对NADPH氧化酶p22phox亚基C242T基因多态性的研究多限于心、脑血管及糖尿病肾病领域，而从分子生物学角度研究有关基因多态性与颈总动脉IMT以及颈总动脉壁粥样硬化斑块的关系的研究在国内极其稀少。本文意在从基因水平研究NADPH氧化酶p22phox亚基C242T基因多态性与IMT的增厚，斑块形成的关系，从而为预测T2DM患者颈总动脉壁粥样硬化斑块的的发生及形成提供分子生物学方面的途径及新的理论依据。

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