骨髓基质干细胞联合rhBMP-2/rhVEGF治疗兔早期激素性股骨头缺血性坏死的实验研究
2011-02-07周传友朱亚林尚希福
周传友,朱亚林,贺 瑞,胡 飞,吴 旅,尚希福
(安徽医科大学附属省立医院骨二科,合肥230001)
激素性股骨头坏死的发病率逐年增高,占非创伤性股骨头坏死的首位[1]。激素性股骨头缺血性坏死发病机制并不完全明确,它可能有多种发病机制。如血管的机械损伤、动脉的血栓和栓塞、静脉回流受阻、持续增高的骨内压等。但不论何种病因,其共同特点是均损害了股骨头的血运,引发股骨头坏死。治疗关键是尽早发现,干预性治疗,重建血供,防治股骨头塌陷、变形。髓芯压是最常用的方法,已经应用30多年,但其疗效仍然有很多争议。随着生物技术、组织工程技术与基因转染技术的发展,对早期激素性股骨头缺血性坏死的治疗带来新希望。本实验通过建立兔早期激素性股骨头坏死模型,采用髓芯减压,将体外增殖的骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)联合重组人骨发生蛋白(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)/重组人血管内皮细胞因子(recombinant human vascular endothelial growth factor,rhVEGF)治疗坏死的股骨头,为临床治疗早期激素性股骨头坏死提供新方法。
1 材料与方法
1.1 实验材料 成年新西兰白兔35只,雌雄不限,体质量2.5~3.0 kg(由安徽医科大学动物实验中心提供);rhBMP-2、rhVEGF分别与卵磷脂混合制成三种片状混合物:rhBMP-2 0.5 mg+卵磷脂40 mg/片;rhBMP-2 0.5 mg+rhVEGF 0.5 mg+卵磷脂40 mg/片,单纯卵磷脂40 mg/片(广州市达晖生物技术有限公司);光学显微镜由安徽医科大学病理教研室提供。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型建立、分组及处理 所选动物均采用Qin等[2]使用的实验方法建立激素性股骨头坏死动物模型。30只兔激素性股骨头坏死动物模型,随机分为5组,每组6只,A组:模型对照组;B组:单纯减压;C组:减压同时植入BMSCs;D组:减压同时植入BMSCs及rhBMP-2卵磷脂。E组:减压同时植入BMSCs及rhBMP-2/rhVEGF卵磷脂。所有动物双侧股骨头均参加实验,术后4、8周各组处死3只动物,作X线检查、组织学观察。
1.2.2 BMSCs的获取和培养 用硬膜外穿刺针刺入兔髂骨1~1.5 mm,以含有100/mL 肝素0.2 mL 的5 mL注射器迅速抽取骨髓2 mL,所获骨髓种植于6孔胞培养板内,每孔种植1 mL,每只实验动物种植2个孔。入含20%胎牛血清DMEM液5 mL,反复吹打,再加入地塞米松10-8mmol/L,微型震荡器上震荡2 min,然后放入细胞养箱内培养。培养箱温度37℃,含5%CO2,100%饱和湿度。5 d后换液,冲去红细胞,可见多个成纤维细胞克隆贴壁长。待细胞长满培养孔面积一半时,用0.25%胰蛋白酶消化,原孔传代,2~3 d可见细胞长满培养孔,将其按1×106/cm2密度传入细胞培养瓶内。待第三代细胞长满后,消化细胞将细胞配成2×106/cm2细胞悬液,复合于3 cm×4 cm的明海绵上。每块明胶海绵含细胞悬液50 μL,共10万个细胞,细胞培养箱中孵育4 h备用。
1.2.3 X线检查 摄髋正位及蛙式位X线片,观察股骨头结构变化。
1.2.4 组织学观察 剖取双侧股骨头连同干骺端,肉眼观察后,置于 10%中性甲醛液 0.1 mol/L,pH 7.4固定3 d。然后置于10%EDTA-Tris缓冲液中脱钙(将 EDTA 溶于 0.1 mol/L,pH 7.4的 Tris-HCL缓存液中制成),每周更换脱钙液1次,观察骨标本表面颜色并用物理法测定其脱钙程度。脱钙完全后取材,逐级脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片然后行HE染色。光镜观察股骨头骨质、骨髓的组织结构变化及骨组织内血管内皮细胞的变化等。在切片中观察骨陷窝时,高倍镜下10×40任选5个高倍视野,计数50个骨细胞空骨陷窝阳性数,取其均数。当观察血管数目时,在软骨下区依次任选5个高倍视野,计血管数目,求出平均值。取置于3%戊二醛液中固定的标本,经缓冲液冲洗后乙醇逐级脱水,醋酸异戊酯保存12 h,CO2临界点干燥并真空喷金,扫描电镜观察。
1.2.5 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析。数据以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析F检验,P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 BMSCs的生长观察及鉴定 骨髓培养到第5天,冲去表面红细胞,可见每个孔内有3~7个成纤维细胞样克隆集落贴壁生长,呈放射状,直径大小不等。单个细胞呈长梭形,胞质丰富,细胞核居中,换液2~3 d后细胞克隆增大,待细胞生长占满培养孔一半时消化传代。消化传代后细胞首先呈圆形透亮,2~4 h后贴壁生长变成短梭形,2~3 d后细胞长满培养瓶底,呈长梭形紧密排列。3代细胞接种后2~7 d呈指数生长,倍增时间为48 h。
2.2 X线检查 4周时A组密度有所增加,骨小梁结构完整,密度增高,B组缺损清晰可见,缺损区未见骨质形成,其余各组减压区密度低于周围骨组织。8周时A组骨小梁结构紊乱,软骨下囊性变,B组缺损仍清晰可见,C组减压区骨密度低于周围骨组织,D、E组骨减压区密度不均与宿主骨密度相当,分界不清。
2.3 组织学检查 A组呈典型骨坏死,骨小梁变细、断裂,可见血管栓塞、空骨陷窝及以纤维结缔组织为主的修复反应;B组4周时开始有新骨形成,但8周时骨组织的成熟度仍不均一;C组4周时可见成骨前体细胞和成骨细胞,但8周时骨改建仍未完成,新生血管少,见少量空骨陷窝;D组4周空骨陷窝减少,可见增生活跃的成骨细胞,并见少量增生血管,新生血管生长不及E组活跃,8周时可见新生骨小梁,新骨改建接近正常松质骨;E组4周时新骨开始形成,新生血管生长活跃,出现大量的新生骨前体细胞和成骨细胞,8周时新骨改建接近正常松质骨。各组术后4、8周后空骨陷窝计数及血管数目计数见表1,经统计学处理,E组骨陷窝阳性数及与血管数目与各组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。
表1 各组术后4、8周后空骨陷窝及血管数目计数(±s,个)
表1 各组术后4、8周后空骨陷窝及血管数目计数(±s,个)
A组24.50 ±1.38 24.33 ±1.37 3.83 ±1.47 3.17 ±1.17 B 组 22.17 ±1.33 20.17 ±1.17 4.50 ±1.38 5.00 ±1.41 C 组 19.67 ±1.37 16.33 ±0.82 5.33 ±1.03 5.17 ±0.98 D 组 17.33 ±1.03 11.33 ±0.82 5.00 ±1.41 5.50 ±1.05 E 组 14.33 ±1.21 8.17 ±0.41 7.17 ±1.17 8.50 ±1.38 F 53.694 275.126 5.539 15.136 P <0.05 <0.05 <0.05 <0.05
3 讨论
激素性股骨头坏死的发病率逐年增高,但其病因、发病机制较复杂,目前尚无定论,但其最后均出现一个共同特征——骨内微循环受阻,血流淤滞,从而使骨髓组织压力增高,形成恶性循环,导致股骨头缺血坏死以及随之出现的修复反应,进而发生股骨头坏死、塌陷及髋骨关节炎,是一个恶性循环的发病过程。早期治疗的关键是恢复股骨头的血液供应、促进坏死骨组织的修复、防治股骨头塌陷及骨性关节炎的发生。股骨头坏死临床上治疗方法很多,但目前尚无一种疗效确实可靠、得到公认的方法可治愈股骨头坏死。髓芯减压术因其创伤小,易操作,是治疗早期股骨头缺血性坏死最常用的方法,并已经应用30多年,但其临床疗效一直存在争议。部分学者认为髓芯减压术治疗效果与疾病分期有关。Mont等[3]研究发现,该术式对早期病例疗效良好,临床有效率分别为:Ⅰ期84%,Ⅱ期65%,Ⅲ期47%。
Hernigou等[4]研究激素性股骨头坏死患者坏死区BMSCs数目和活性的变化,认为激素可以降低前体细胞的数量和活性。陈炳鹏等[5]也认为,虽然髓芯减压术可以降低骨内压并刺激减压针道周围的血管形成,增强坏死骨的爬行替代,但是并没有彻底解决股骨头的修复问题,骨髓基质干细胞数量的减少可能是股骨头修复不完全的主要原因。因此,股骨头缺血性坏死可以认为是一种骨髓基质干细胞减少病。严军等[6]通过自体骨髓移植治疗兔实验研究发现,治疗组骨修复较空白对照组活跃,骺板损伤处可见少量软骨细胞,单纯钻孔组以纤维修复为主,认为由于BMSC数目较少,自体骨髓移植治疗兔Perthes病模型能力有限,体外培养增殖BMSC,增加植入细胞数目,有利于股骨头坏死的修复。
BMSCs是一种多能干细胞,能够分化为成骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞及软骨细胞等多种细胞,并且在成骨细胞及脂肪细胞分化之间呈反向变化[7]。骨髓基质干细胞不但具有体外成骨能力,同样也具有体内成骨能力。体外实验证实激素能促使BMSCs向脂肪细胞分化,而抑制其向成骨细胞分化[8]。Kon等[9]将骨髓基质干细胞接种于羟基磷灰石载体上,修复绵羊骨缺损,2个月后发现羟基磷灰石孔内及周围均有骨形成。
牛东生等[10]发现股骨头坏死骨髓基质中成骨蛋白2及VEGF表达减少,并认为其与股骨头内的成骨活动、基质干细胞的转化及血管生成密切相关。胡志明等[11]将血管内皮生长因子脂质体治疗坏死的兔股骨头,5周发现股骨头结构变清晰,骨质破坏明显修复,软骨细胞修复性增生,骨髓腔造血组织出现增生,栓塞的血管旁边出现新生的血管。孙明林等[12]通过髓芯减压联合rhBMP-2治疗兔激素性股骨头缺血性坏死,术后8周发现原骨缺损区基本消失,大量相对较成熟的骨小梁及板状骨并存。Yeh等[13]发现,VEGF通过促进局部血管增生和成骨细胞分化而参与了成骨活动,而成骨蛋白等则通过提高成骨细胞VEGF的表达而在骨的形成和修复中发挥作用,这些骨生长因子可刺激VEGF在体内表达,VEGF不足可导致血管腔闭合,血管退化。所以,骨髓基质干细胞若能结合其他促进股骨头隧道内血管再生及骨形成的细胞因子治疗股骨头坏死,将加快股骨头的修复,提高临床疗效。
本实验正是通过将体外培养的 BMSCs联合rhBMP-2/rhVEGF治疗兔激素性股骨头坏死,结果显示股骨头结构清晰,骨小梁结构完整,骨质破坏明显修复,股骨头的空缺骨陷窝数明显减少,出现大量新生骨前体细胞和成骨细胞及生长活跃的新生血管,骨陷窝阳性数及血管数目各组比较差异有统计学意义。BMSCs联合rhBMP-2/rhVEGF治疗兔激素性股骨头坏死具有较好的疗效。但rhBMP-2及rhVEGF外源性细胞因子用于股骨头缺血性坏死的治疗是一个极其复杂的过程,其在人体内发挥作用的确切机制及代谢途径,以及体内微环境对它们作用的影响等均不十分明确,因此对于外源性细胞因子治疗股骨头缺血性坏死的研究期待进一步深入,从而为最终将其过渡至临床治疗提供理论依据。
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