补气法、化痰法对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

叶宗果 雍苏南 严浩成

1广东省新丰县人民医院（广东新丰510095）

2湖南中医药大学第一附属医院（湖南长沙410007）

3广州中医药大学热带医学研究所（广东广州510405）

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性wistar大鼠50只、体质量（275±30）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪2007-0005）。

1.2 药物 选择保元汤（黄芪、人参、肉桂、甘草）为补气法之载体，瓜蒌薤白半夏汤（瓜蒌、薤白、半夏、白酒）为化痰法之载体。药材均购自湖南中医药大学第一附属医院中药房。

1.3 仪器与试剂 Micro-ESR型电子自旋共振波谱仪，美国产；TD5-Ⅱ台式离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司生产；721分光光度计，上海第三仪器厂生产；SSW型电热恒温水槽，上海博迅实业有限公司提供；Thermo Shandon切片机，英国产；LKB-Ⅱ型超薄切片机，瑞典产；OPTON万能光学显微镜，德国产；H-600透射电镜，日本产。原位细胞凋亡检测试剂盒、Bcl-2、Bax免疫组化检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）,丙二醛（MDA）测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.4 分组及造模 参照文献［2］的方法，制备高脂乳剂，对50只wistar大鼠按10mL/kg灌胃，每日1次，连续12周。随机抽取2只大鼠，处死后速取主动脉，浸入4%多聚甲醛溶液中，固定48h，石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜下观察发现已形成粥样硬化斑块，提示造模成功。随机分成4组，即假手术组、模型组、补气法组、化痰法组，每组10只动物。在大鼠AS模型的基础上，手术建立大鼠MIRI模型：大鼠称体质量后，予氯胺酮80mg/kg经腹腔注射麻醉。气管切开接呼吸机人工呼吸，记录Ⅱ导联心电图。开胸后以左冠状静脉主干为标志结扎左冠状动脉。以心电图ST段明显抬高、结扎点远端心肌发绀为结扎成功标志。结扎冠状动脉左前降支30min，复流3h。假手术组，只穿线不结扎冠脉。

1.5 给药方法 保元汤、瓜蒌薤白半夏汤水煎剂参考文献［3］制备。给药剂量按60kg成人与动物体表面积换算，保元汤以0.95g生药/kg灌胃，瓜蒌薤白半夏汤以0.59g生药/kg灌胃，给药体积均按1mL/100g计算，于缺血再灌注前30min给大鼠灌胃，模型组及假手术组注入等量生理盐水。

1.6 心肌凋亡细胞原位检测 采用原位末端TUNEL法标记凋亡心肌细胞，具体操作步骤按照试剂说明书进行。每张切片随机于×400物镜下取5个视野，每组共40个视野，细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡阳性细胞，计数凋亡阳性细胞，以凋亡指数(AI）反映各组心肌细胞凋亡的情况。AI=（视野内凋亡细胞个数/视野内所有心肌细胞个数）×100%。

1.7 Bcl-2、Bax基因蛋白表达的检测 采用链酶亲和素-生物素-酶复合物 （SABC）免疫组化检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白表达。在光镜下200倍放大，通过图像分析系统每张切片随机选取10个视野，胞浆着棕黄色者为阳性表达细胞，测定阳性染色的平均光密度与阳性细胞百分比，计算蛋白阳性表达指数（PEI）：PEI=平均光密度×阳性细胞百分比×100，并求出Bax／Bcl-2的比值。

1.8 氧自由基的检测 采用电子共振自旋波频谱仪定量检测心肌细胞氧自由基量。用黄嘌呤氧化酶法检测血清SOD活性，用硫代巴比妥（TBA）法检测MDA含量。

2 结 果

2．1 对各组大鼠心肌细胞凋亡的影响 见表1。光镜下观察，假手术组偶见凋亡阳性细胞，模型组有大量的心肌细胞凋亡，且积聚成团，AI显著高于假手术组（P＜0．01）。补气法组、化痰法组心肌细胞 AI均较模型组明显减少（P＜0．01）。

表1 各组大鼠AI及凋亡相关蛋白水平比较 （±s）

表1 各组大鼠AI及凋亡相关蛋白水平比较 （±s）

与假手术组比较，*P＜0．01；与模型组比较，△P＜0．05。 下同。

组 别 n AI（%） Bc1-2蛋白 Bax蛋白 Bax/Bcl-2假手术组 10 3．30±0．70 0．22±0．03 0．23±0．04 0．88±0．34模型组 10 29．60±7．10* 7．32±2．03* 18．44±5．59* 3．27±0．11*补气法组 10 15．40±5．80*△△ 7．48±2．02* 18．14±5．41* 3．26±0．11*化痰法组 10 16．70±5．50*△△ 17．62±4．89*△△ 5．40±1．21*△△ 0．35±0．57*△△

2．2 对各组大鼠Bcl-2与Bax基因蛋白表达的影响 见表1。在假手术组中，Bcl-2、Bax蛋白表达量都较少，Bax/Bcl-2比值接近1；与假手术组比较，模型组Bcl-2和Bax的表达量均有所上升（P＜0．01），但以 Bax 蛋白表达更明显，Bax／Bcl-2 显著增高（P＜0．01）；与模型组比较，补气法组Bcl-2和Bax的表达量无明显上升（P＞0．05）； 化痰法组 Bcl-2 的表达量显著升高（P＜0．01），Bax 的表达量则明显下降（P＜0．01），Bax／Bcl-2 也显著低于模型组（P＜ 0．01）。

2．3 对各组大鼠心肌SOD、MDA含量的影响 见表2。假手术组心肌组织的SOD具有较高的活性，MDA处于较低的水平。模型组同假手术组比较，则有明显的氧化趋势，SOD活性显著降低（P＜ 0．01），MDA 含量显著增高（P ＜ 0．01）；同模型组比较，补气法组、化痰法组 MDA 含量降低（P＜0．01），SOD活性显著增高（P＜0．05 或 0．01）；补气法在降低 MDA 含量、升高 SOD 活性方面优于化痰法，其差异有统计学意义（P＜0．05）。

表2 各组大鼠血清SOD活性与MDA含量比较 （±s）

表2 各组大鼠血清SOD活性与MDA含量比较 （±s）

与补气法组比较，▲P＜0．05。

MDA（μmol/g）假手术组 10 2．85±0．32 5．92±1．23模型组 10 1．33±0．14* 17．20±2．48*补气法组 10 2．20±0．25*△△ 7．85±1．72*△△化痰法组 10 1．80±0．22*△▲ 9．54±1．63*△△▲组 别 n SOD（mkat/g）

3 讨 论

心肌缺血再灌注损伤是急性心肌梗死早期再灌注治疗过程中一个严重的并发症。研究发现，再灌注损伤发病机制中一个重要的环节是心肌细胞凋亡。本实验结果表明，心肌缺血再灌注后凋亡明显增多，而使用2种不同中医治法的方药后凋亡细胞明显减少，说明中医补气法、化痰法均可减轻心肌缺血再灌注损伤。

在心肌缺血再灌注损伤中，凋亡的发生是受细胞周围的刺激信号诱导或抑制，并由特定的基因控制。Bax基因与Bc1-2基因具有高度的同源序列，Bax蛋白与Bc1-2蛋白可相互结合形成结合体，过度表达Bax蛋白可促进细胞凋亡并抑制Bcl-2的抗凋亡作用。因此，Bax和Bc1-2表达的比例决定细胞是生存还是凋亡。本实验发现假手术组中Bcl-2和Bax及凋亡细胞表达很少，而模型组Bcl-2表达增加，有报道认为与心肌细胞受到缺血再灌注过程的刺激而反应性表达，以提高细胞的内在抵抗能力有关［4］。 但 Bax 表达更多，Bax／Bcl-2 比值增大，凋亡细胞增多，这进一步证明了Bax／Bcl-2比值与细胞凋亡的密切关系。给予2种不同治法的方药后，化痰法组Bc1-2表达上调，Bax表达下调，Bax／Bcl-2比值下降，而补气法组的Bax和Bc1-2表达无明显改善，提示化痰法可上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白的表达，抑制心肌细胞的凋亡，以减轻心肌缺血再灌注损伤，而补气法可能从其他分子途径拮抗MIRI。

心肌细胞内氧自由基大量产生是再灌注心肌损伤发病的重要机制之一。SOD是体内存在的一种抗氧自由基酶,其活力的高低间接反应了机体清除氧自由基（OFR）的能力［5］,MDA为OFR发生脂质过氧化反应过程中形成的脂质过氧化物,其水平间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度。两者的变化可反映心肌的抗氧化能力［6］。本实验显示：与模型组比较，2个中药治疗组大鼠在经历心肌缺血再灌注后，其SOD活性均明显增高，MDA含量均明显降低，提示中医补气法、化痰法均能够有效清除氧自由基，提高机体抗氧化能力。但化痰法组在增高SOD活性及降低MDA含量方面均无补气法组明显，说明中医补气法、化痰法均能通过促进清除大鼠心肌细胞心肌缺血再灌注时所产生的氧自由基，但化痰法的作用效果不及补气法。

本实验表明，补气法则主要通过清除OFR来预防缺血再灌注时心肌细胞发生凋亡，减轻损伤。而化痰法主要通过清除OFR，上调Bcl-2表达、下调Bax表达，最终达到保护心肌的目的。两种中医治法均能有效预防MIRI后的细胞凋亡，对心肌缺血再灌注损伤有良好的保护作用。

［1］ Brodie BR．Whatanti—thrombotic therapy 1Sbestwith primary PCIfor acute ST elevation myocardial infarction：how should the HORIZONS trialchange currentpractice?［J］．Catheter Cardiovasc Interv，2008，71（6）：816-821．

［2］ 刘明，董超仁，苏静怡．一种简便实用的大鼠高脂模型［J］．中国药理学通报，1989，5（2）：119．

［3］ 李仪奎．中药药理实验方法学［M］．上海：上海科技出版社，1991：36．

［4］ Palojoki E．Saraste A，Eriksson A，et a1．Cardiomyocyte apoptosis and ventricular remodeling after myocardial infarction in rats［J］．Am，PhysiolHeartCirc Physiol，2001，280（6）：2726-2731．

［5］ Von Harsdoff R，Li PF，Dietz R．Signaling pathways in reactive oxygen species-induced cadiomyocyte apoptosis［J］．Circulation，1999，99（22）：2934-2941．

［6］ Toledo Pereyra LH，Lopez N F，Toledo A H．Reactive oxygen species andmolecularbiology of ischemia/rep erfusion［J］．Ann Transplant，2004，9（1）：81-83．