真武汤对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响*

陈国庆 姚淮芳

1安徽中医学院（安徽合肥230038）

2安徽省中医院（安徽合肥230031）

慢性心力衰竭（CHF）的基本病因是原发性心肌损害以及前后负荷增加，与交感神经兴奋，肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活密切相关。近年来研究证明，心肌细胞凋亡是CHF过程中心肌细胞丧失的重要机制，心肌细胞凋亡亢进参与了CHF的基本病理生理进程［1-2］。心肌细胞凋亡是心肌肥大向心衰转化的关键因素。因此，抑制心肌细胞的凋亡对心衰的治疗十分重要。选择有效的药物进行早期干预，打断心力衰竭的恶性循环，就可延缓心力衰竭的发生发展。

1 材料与方法

1．1 动物及药物 健康雄性 wistar大鼠 60只，体质量200～240g，购于安徽全椒动物公司。真武汤组成：熟附片10g，茯苓15g，白术10g，生姜15g，白芍15g。按比例配伍组成，加入500mL水，煎30min，过滤浓缩至1．0g/mL，由安徽省中医院制剂中心提供。注射用青霉素，由华北制药股份有限公司提供，批号：X1002321。依那普利片，由江苏扬子药业公司提供，批号H3202731。

1．2 主要试剂 Trizol试剂、逆转录试剂盒，PCR试剂和Taq DNA聚合酶，DNA Marker（美国Fermentas公司）、琼脂糖凝胶（OXOID，英国），溴化己锭（10mg/mL，Sigma 公司，美国），引物用Primer Premier 5．0软件设计，并由上海生工技术有限公司合成。bcl-2、bax、β-actin兔抗人单克隆抗体：购于博士德生物工程有限公司。羊抗兔IgG（辣根过氧化物酶标记），购于联科生物技术有限公司。EZ-ECL增强型化学发光显色试剂盒，购于Biological Industries公司。PVDF膜，购于Millipore公司。丽春红，购于碧云天生物技术研究所。考马斯亮蓝G-250，购于上海化学试剂厂。考马斯亮蓝G-250蛋白测定试剂盒，购于南京建成生物工程研究。抗体稀释液，购于博士德生物工程有限公司。

1．3 主要仪器 PCR仪器（美国ABI公司），DYY-6B型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂），TGL-18R冷冻离心机（黑马仪器公司），TGL-16H冷冻离心机（黑马仪器公司），紫外观察灯UV型（珠海黑马医学仪器有限公司），GSM凝胶图像分析管理系统（3．0），组织匀浆器，电子天平（JY2002，FA2004，上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂）。

1．4 分组与造模 大鼠随机分为假手术组、模型组、真武汤组、依那普利组。每组15只。采用腹主动脉缩窄法制作CHF大鼠模型［3］：大鼠经 10%乌拉坦（1．0g/kg）腹腔注射麻醉后，行腹部正中切开，分离肾动脉上方的腹主动脉约1cm长，用7号针头紧贴腹主动脉平行放置，并将两者一起结扎，然后抽出7号针头，即可使腹主动脉部分狭窄。术后，大鼠给予青霉素10000U，连续3d以预防感染。所有大鼠均饲以鼠饲料及瓶装饮用水。各组均于造模4周后开始给药。每日晨9：00，大鼠经口腔插管于胃内，真武汤组予真武汤 3mL/（kg·d），依那普利组予依那普利 10mg/（kg·d），假手术与模型组予生理盐水 3mL/（kg·d）。

1．5 血流动力学指标测定 腹主动脉结扎3周后，观察实验动物是否出现失代偿症状，如呼吸急促、心动过速和劳力性呼吸。以0．3%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，分离颈总动脉，插入聚苯乙烯左心导管至左心室，连接八导生理记录仪（RM-600型）记录其左心室压峰值（LVP）、左室舒张末期压（LVEDP）、左室内压最大收缩率 （+LV dp/dtmax）、左室内压最大舒张率（－LVdp/dtmax）及平均动脉压（MAP）和心率（HR）。

1．6 RT-PCR方法测定Bcl-2、BaxmRNA的表达 取大鼠心肌组织，常规方法提取RNA，按RT-PCR试剂盒要求进行反转录反应和PCR扩增Bcl-2、Bax目的基因片段。Bcl-2上游引物：5′-CTTCCAGCCTGAGAGCAACC-3′， 下游引物：5′-CATCCCAGCCTCCGTTATCC-3′， 扩增片段长度为 431bp；Bax 上游引物：5′-CCAAGAAGCTGAGCGAGTGTC-3′， 下 游 引 物 ：5′-TGAGGACTCCAGCCACAAAGA-3′，扩增片段 284bp；内参照 β-actin上游引物：5′-GAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′，下游引物：5′CACGTCACACTTCATGATGGAG-3′，扩增片段长度为 500 bp。PCR 反应条件为 94℃预变性 5min，94℃ 35s，54℃ 35s，35 个循环后，72℃ 35s，72℃延伸 5min，4℃ 99min。 PCR 扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳分离，扫描成像，用凝胶成像分析系统进行密度分析。以β-actin作为内参照。用各目的基因片段密度值/内参照密度值的比值进行比较。

1．7 Western Blot法检测Bcl-2、Bax蛋白的表达 取大鼠心肌组织，常规方法提取蛋白质，定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，用一抗4℃孵育过夜，PBS漂洗3次后加二抗 HRP（辣根过氧化酶）-IgG（1∶1000），室温孵育 2 h，化学发光法显色，对条带进行吸光度积分扫描。GAPDH作为内参照。用各蛋白吸光度值/内参照吸光度值的比值进行比较。

1．8 统计学处理 数据以（x±s）表示，应用 SPSS 12．0统计软件。用单因素方差分析进行组间比较。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 真武汤对心衰大鼠血流动力学指标的影响 见表1。假手术组与模型组相比具有显著差异（P＜0．01），模型组与中药组、西药组比较差异有统计学意义（P＜0．05），中药组与西药组比较无显著差异。

表1 各组大鼠血流动力学指标比较 （±s）

表1 各组大鼠血流动力学指标比较 （±s）

与模型组比较，△P＜0．05，△△P＜0．01。下同。

组 别心率（次/min）-3123．89±989．57△△ 428．36±39．58△△-1342．87±826．48 328．17±32．73-2578．35±671．37△ 389．25±32．57△-2279．78±1297．68△ 372．40±27．68△n -dp/dtmax（mmHg/ms）15 15中药组 15西药组 15假手术组模型组LVSP（mmHg）135．09±28．09△△72．67±13．67 109．19±13．42△112．09±21．14△LVEDP（mmHg）12．98±9．87△34．45±10．01 7．89±11．36△5．98±12．03△+dp/dtmax（mmHg/ms）4523．17±1021．67△△1627．79±698．12 3421．17±874．02△3462．48±931．17△

2．2 各组Bcl-2、Bax蛋白表达比较 与假手术组相比，模型组Bcl-2、BaxmRNA 及蛋白表达均显著上升（P ＜ 0．01）；与模型组相比，真武汤组Bcl-2mRNA及蛋白表达均显著上升，BaxmRNA 及蛋白表达均显著下降（P＜0．05 或 0．01）。 见表 2、图 1。

3 讨 论

真武汤是医圣张仲景《伤寒论》中温阳利水代表方，主治少阴病阳虚水泛证。少阴病与CHF有密切的相关性，充血性心力衰竭心排出量不足时，末梢循环减弱，末梢血管收缩，表现为肢端发冷、苍白、脉微细。这与少阴病心肾阳虚推血无力，阳气不能温煦四肢的见症是相同的。据此许多学者应用真武汤治疗CHF取得了显著疗效。本研究表明，真武汤对CHF心肌细胞凋亡有良好的抑制作用，作用与依那普利组相当，抑制心肌细胞凋亡为该方改善CHF的主要机制之一，也为临床治疗心力衰竭提供参考。

本文结果显示，模型组有大量的心肌细胞凋亡，而假手术组几乎没有心肌细胞凋亡。尽管TUNEL标记阳性（凋亡小体）的细胞不一定是心肌细胞，但是近来的文献报道几乎所有的凋亡小体都是心肌细胞［4-5］。心肌细胞凋亡伴随着上调有促进调亡作用的Bax蛋白表达，下调有抑制凋亡作用的Bcl-2蛋白表达，提示调亡蛋白表达失衡，促进了心肌细胞凋亡的发生，进而促进了CHF的发生、发展［6］。本研究发现模型组有大量的心肌细胞凋亡，表明细胞凋亡在CHF的发展过程中起了一定的作用，通过细胞凋亡丧失心肌细胞促进了CHF的发生发展。并且左室舒张末压升高、收缩末期压降低、室内压最大上升速度与下降速度均减少，左心收缩功能、舒张功能明显的下降，也发生了一定程度的心室重构，心肌细胞凋亡与心功能降低、心室重构有较强的相关性。

表2 各组 Bcl-2、Bax蛋白表达比较 （±s）

表2 各组 Bcl-2、Bax蛋白表达比较 （±s）

与假手术组比较，*P＜0．01。

组 别 Bcl-2 Bax n mRNA 蛋白 mRNA 蛋白0．41±0．04 0．63±016*真武汤组0．37±0．03 0．57±0．15*0．58±0．03△△依那普利组 0．68±0．16 1．47±0．14△△ 0．55±0．11△ 1．41±0．13△△假手术组0．66±0．04模型组 1．01±0．19*15 15 15 15 1．04±1．13△△0．91±0．13 1．18±0．15*2．12±0．26△△0．77±0．08△△

图1 各组Bcl-2、BaxmRNA及蛋白表达电泳图

［1］ Haunstetter A，Izumo S．Future perspectivesand potential implications of cardiacmyocyteapoptosis［J ］．Cardiovasc Res，2000，45 （3）：795-801．

［2］ Narula J，Kolodgie FD，VirmaniR．Apoptosisand cardiomyopathy［J］．CurrOpin Cardiol，2000，15 （3）：183-188．

［3］ 朱丹，郭艳红，于海奕，等．两种早期心衰大鼠模型的建立和心功能的比较［J］．中国比较医学杂志，2009，19（9）：20-24．

［4］ Itescu S，SchusterM D，Kocher A A．New directions in strategiesusing cell therapy forheartdisease［J］．JMolMed，2003，81（5）：288．

［5］ Abbate A，Biondi-ZoccaiG G，Bussani R，et al．Increasedmyocardial apoptosis in patientswith unfavorable left ventricular remodeling and early symptomatic post-infarction heart failure［J］．JAm CollCardiol，2003，41（5）：761．

［6］ 孙婷，史红霞，孙秀菊，等．Bcl-2，Bax，Bcl-XS，Bcl-XL 在心力衰竭大鼠心肌的变化及意义［J］．潍坊医学院学报，2007，29（2）：131-133．