圆环病毒2型SD/2008株在人工感染仔猪组织器官中的分布

梁方印 尹秀玲 康 敏 宋庆华

（河南濮阳县畜牧局，河南濮阳 457000）

圆环病毒2型SD/2008株在人工感染仔猪组织器官中的分布

梁方印 尹秀玲 康 敏 宋庆华

（河南濮阳县畜牧局，河南濮阳 457000）

自1991年harding首次报道加拿大发现断奶仔猪多系统衰弱综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）以来，猪圆环病毒2型（Porcine cirovirus type 2,PCV-2）感染及其所致疾病已遍及世界各地，成为危害世界养猪生产的一大疫病。我国对PCV-2的研究始于1999年年底，有学者对我国部分猪群的流行病学调查发现猪群中广泛存在PCV-2抗体。PCV-2是PMWS的主要致病病原，在临床上主要感染5～12周龄的断奶仔猪。2008年重庆、新疆、湖南、浙江、广东、上海、辽宁、黑龙江、福建等10多个省市自治区先后发现了猪群混合感染该病的病例。陈焕春等人2003年～2008年的临床病例分析，发现我国圆环病毒抗体阳性率达到37.92% （1792/4726），病原阳性率达到23.8% （360/1510），且呈逐年上升的趋势。由此可见，PCV-2在我国猪群的感染情况已经相当严重。因此，我们有必要对PCV-2进行继续的研究。

本研究旨在使用免疫组化技术分析PCV-2感染猪病毒抗原在猪各重要器官及组织中的分布，从细胞水平揭示PCV-2感染对猪机体各器官组织的嗜性，为研究PCV-2的致病性提供帮助。

目前，实验室对PCV-2抗原的常规诊断技术包括：1）间接免疫荧光（Indirect immunofluorescent antibody,IFA）技术；2）聚合酶链反应 （Polymerase chain reaction,PCR）；3）原位核酸杂交检测技术；4）限制性长度多态性 分 析 （Restriction fragment lengt hpolymorphism,RFLP）；5）基因芯片检测技术；6）免疫胶体金技术 （Immune colloidal gold technique,ICGT）；7）酶联免疫吸附试验 （Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）；8）免疫过氧化物酶单层细胞试验；9）免疫组织化学方法等。前八种方法对实验设备和技术人员要求高，操作程序复杂，不易在基层单位普及，但是免疫组织化学技术（Immunohistochemistry,IHC）是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下，借助于酶细胞化学的手段，于光镜下观察分析检测某物质在组织细胞内存在部位的一门技术，具有特异性强，灵敏度高，简单易行等特点，能将形态研究与功能、代谢研究有机地结合在一起，具有更大的优越性和广阔的应用前景。

本实验以兔抗猪圆环病毒2型ORF2（PCV-2-ORF2）重组蛋白的特异性抗体作为一抗，将辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）标记的羊抗兔IgG作为二抗，探索通过IHC的方法检测猪圆环病毒2型 （PCV-2）抗原，以期建立实验室对PCV-2病毒抗原进行准确的定性，以及对抗原的动态分布进行准确定位的诊断方法。

1 实验材料

1.1 病毒及实验动物

1.1.1病毒

猪圆环病毒2型SD/2008株，病毒滴度 （TCID50）为105.61/0.1 mL。河北农业大学动物传染病学实验室分离保存。

1.1.2试验动物

6头35日龄健康杜洛克×长白杂交猪，经PCR检测PCV-2、PPV、PRV、PRRSV及CSFV核酸均呈阴性，ELISA检测血清抗PCV-2抗体为阴性。

1.2 实验器材

YD-12P全自动生物组织脱水机（购自浙江省金华市益迪医疗设备厂）；YD-6L全自动生物组织冷冻包埋机（购自浙江省金华市益迪医疗设备厂）；YD-1508R轮转式切片机 （购自浙江省金华市益迪医疗设备厂）；恒温箱 （购自上海智城分析仪器制造有限公司）；一次性切片刀片 （日本羽毛牌）；YD-A摊片机 （购自浙江省金华市益迪医疗设备厂）；YD-B烤片机 （购自浙江省金华市益迪医疗设备厂）；电子天平 （购自上海民桥精密科学仪器有限公司）；显微镜及数码显微照相系统 （购自北京麦克奥迪公司）；YABO700电脑自动染色机 （购自常州市雅博电子设备有限公司）；载玻片 （规格：25.4×76.2 mm）用多聚赖氨酸处理。将APES用丙酮1: 50稀释，取干净的玻片浸泡30分钟，取出后略干燥一会 （视温度而定，一般1～5分钟）。纯丙酮涮洗2～3次。捞出后无尘处干燥或烘烤，密闭后可保存半年以上。每次的稀释液均必须新鲜配制。

其它用具：盖玻片、切片刀、镊子、剪刀、毛笔、包埋盒、包埋皿、染缸及染液、酒精灯、高压锅、通风橱等。

1.3 实验试剂

1%H2O2-甲醇

17mLH2O2（30%）加入500 mL甲醇4℃保存。

PBS （无叠氮化钠， pH 7.2～7.4，10倍浓度）：

加入蒸馏水定容至1 000 mL，121℃高压灭菌。贮藏于4℃冰箱中，用前稀释10倍。

用0.1 mol/L的NaOH将pH调至7.8。

10×DAB贮存液

称取50 mg DAB（sigma）溶于10 mL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液 （pH=7.4）中，此为10倍溶液，分装0.5mL安培管中，贮于-20℃备用。

用时稀释。取0.5 mL 10×DAB贮存液加入4.5 mL （pH=7.4）Tris-HCl缓冲液，可以用滤膜注射器或300 rpm离心5分钟，取上清。加入15μL 30%的 H2O2，此后立即使用。每张切片滴加4滴，覆盖切片，放置15～30分钟，至显棕色为止。也可在10 mL DAB溶液中加入2滴30%的H2O2，即30%W/V H2O2（100 volume），加在切片上5分钟后观察显色情况。也可在显微镜下检查阳性标本染色情况。

苏木素染液

甲液（苏木素0.9 g，无水乙醇10 g）

乙液（硫酸铝钾20 g，蒸馏水200mL）

配制时分别配好甲、乙两液，然后将甲，乙液混合并加热煮沸，带液体沸腾后将盛液体的烧杯移开火焰，缓缓加入氧化汞1.25 g，并搅拌均匀，直至氧化汞完全溶解后再将烧杯迅速放入冷水中冷却，放置第二天过滤即可。注意加入冰醋酸20mL可使细胞核着色好。

4%多聚甲醛

40 g多聚甲醛溶于 0.1 mol/L PBS（不含钾）中，于60～65℃加热搅拌溶解（用NaOH调pH 7.0～7.4），定容到1 000 mL，4℃保存待用。

载玻片

将APES用丙酮1：50稀释，取干净的玻片浸泡30分钟，取出后略干燥一会 （视温度而定，一般1～5分钟）。纯丙酮涮洗2～3次。捞出后无尘处干燥或烘烤，密闭后可保存半年以上。每次的稀释液均必须新鲜配制。

其它材料

乙醇：质量分数梯度溶液为 （70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇）；二甲苯：1:1的二甲苯和乙醇溶液；1%盐酸酒精；石蜡；冰醋酸；中性树脂；猪PCV阳性血清；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG血清；兔抗PCV-2多克隆抗体，河北农业大学预防兽医学实验室保存。

2 实验方法

2.1 动物感染

将6头35天的健康仔猪随机分为PCV-2感染组和非感染对照组，每组3头。将猪圆环病毒2型SD/2008株经口鼻途径接种感染组猪，对照组用RPMI 1640培养基以相同接种途径接种，攻毒剂量为3mL/只。两组猪进行严格隔离饲养，饲养方法与饲养条件完全相同。接种病毒后35天分别剖杀感染组和对照组。采集淋巴结 （下颌淋巴结、腹股沟浅淋巴结）、肝、脾、肺、肾做石蜡切片。

2.2待检组织石蜡切片的制备

取待检的组织块置于10%中性甲醛溶液中固定24小时以上，然后脱水、透明、浸蜡、包埋。每份样品制备厚度为4μm的切片2张，做免疫组织化学染色。

2.2.1组织切片的制作

2.2.1.1取材

PCV-2感染猪后35天，剖杀感染组和对照组猪，分别按规格取各组猪的肝、脾、肺、肾、脑、肠、淋巴结等组织作为制片材料，并实施编号以防混乱。病料组织大小为1 cm×1 cm×0.3 cm。

2.2.1.2固定

固定液采用新配的4%新鲜甲醛溶液，将采取病料固定24小时以上。固定液的用量为材料的20～30倍。

2.2.1.3 脱水

常规梯度乙醇脱水，采用逐级提高酒精浓度 （70%→80%→90%→95%→100%）进行样本脱水，脱水时间分别为2小时。

2.2.1.4透明

透明剂选取的是二甲苯，透明时间应由组织大小而定，各级停留时间在30分钟至2小时，在纯二甲苯中更换2次，总时间为3小时。

2.2.1.5浸蜡

充分浸蜡，时间为2～3小时。此步骤是在温箱内进行，温度调至60℃，恰好使石蜡溶解。

2.2.1.6包埋

包埋之前应将包埋皿与包埋镊子一起放在温箱中加热。快速认真地将组织埋入石蜡，凝固成块。

2.2.1.7 切片

2.2.1.7.1 石蜡块的固着与修整

固着：用加热的蜡铲将包埋块粘贴于固着物上，并使组织块朝外，便于以后切出所需的片子。

修整：用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，常保留组织周围附着宽2.5 mm的石蜡，修好的蜡块呈长方形。再削去一小角以便于分离蜡带。

2.2.1.7.2 切片方法

切片前，将刀口置放大镜下观察，选择刀口平整无缺的部分来进行切削。将所要切的包埋块固定在标本台上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块稍露出一截。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行。在微动装置上调节切片要求的厚度4μm，调节时应注意指针不可在两个刻度之间，将刀台移至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触，开始切片。右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接住切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片速度不宜太快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机剧烈震动引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子。切片完毕，应及时用氯仿将切片机擦净。

2.2.1.8贴片

采取捞片法，即首先将切片分割开，投入到42℃的温水浴中，这时切片都浮在水面上，由于表面张力的作用使切片自然展平，然后用先前处理好的载玻片倾斜着插入水面去捞取切片，使切片贴附在载玻片的合适位置，于37℃恒定的烫板上让切片摊干，之后移入37℃恒温箱中烤片24小时。

2.3免疫组化 （IHC）染色

石蜡切片放入二甲苯Ⅰ作用15分钟；二甲苯Ⅱ作用15分钟；无水乙醇作用2分钟；95%乙醇作用2分钟；85%乙醇作用2分钟；75%乙醇作用2分钟；蒸馏水作用2分钟。

切片浸于1%H2O2-甲醇 （消除内源性过氧化物酶）液体中，室温作用30分钟；洗涤液 （0.01 mol pH=7.4 PBS，含0.05%Tween-80）洗3～4次，每次3～5分钟。

切片组织上方滴加0.1%～0.25%胰酶溶液 （PBS配制，含0.1%氯化钙，pH=7.8，用前预温至37℃）37℃作用15分钟 （暴露抗原）。

同上洗涤后加封闭液 （0.01 mol pH=7.4 PBS配制的1%BSA），放入湿盒中，37℃作用30分钟。

甩去封闭液，不经洗涤直接加适量经稀释 （稀释液为0.01 mol pH=7.4 PBS配制的0.1%BSA,含0.05%Tween-80）的一抗 （1:100、1:200、1:400、1:800），放入湿盒中，37℃45分钟 （或4℃过夜）。

同上洗涤后，加适量经稀释 （稀释液为0.01 mol pH=7.4 PBS配制的0.1% BSA，含0.05%Tween-80）的二抗（HRP标 记 的 羊 抗 猪 IgG） （1:100、1:200），放入湿盒中37℃30～45分钟。

经洗涤后加新鲜配制的DAB溶液，避光作用5～15分钟，于蒸馏水中终止显色 （2分钟以上）。

用harris苏木素作用适当的衬染，流水冲洗，1%盐酸酒精分化，流水冲洗、晾干，用含二甲苯的中性树胶封片，光镜下观察结果。

2.4免疫组化结果的判定方法

在光学显微镜下，出现棕黄色信号的细胞为阳性细胞，表示其内有PCV-2存在。随机选3个视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞的百分率，代表该组织器官内PCV-2的含量。

3 实验结果与分析

3.1 器官组织剖检变化

如表1所示，接种后35天将实验动物剖杀，发现其肝脏有不同程度的虎斑状病变；腹股沟淋巴结轻微肿大；颌下淋巴结肿大或坏死；脾脏大头明显肿大，小头呈锯齿状，大头脾门淋巴结梗死；肺脏严重肉变，整个肺呈花斑样淤血出血，右侧隔叶灰黄色病灶，左侧尖叶气肿；肾脏大部分呈黄色，皮质出现米粒大的坏死灶。对照组猪无肉眼明显可见的剖检病变。

3.2部分猪组织器官中PCV-2的免疫组化检测结果

表1 感染35天 （dpi）PCV-2感染猪器官组织的剖检病变

表1 感染35天 （dpi）PCV-2感染猪器官组织的剖检病变

用免疫组化方法检测攻毒后各组猪的淋巴结 （颌下淋巴结、腹股沟浅淋巴结）、肝、脾、 肺、肾、等免疫器官中PCV-2的分布，检测结果见图1～4和表2，PCV-2 SD/2008株能感染多种组织，在仔猪的颌下淋巴结、腹股沟浅淋巴结、肝、脾、肺等组织中都能检测到大量病毒抗原。PCV-2在猪体内的主要靶细胞是单核/巨噬细胞，在IHC阳性组织中，病毒抗原主要定位于各种上皮组织，例如颌下淋巴结巨噬细胞，肺泡内淋巴细胞及细支气管上皮细胞，腹股沟淋巴细胞，肝巨噬细胞等，在各组织中，淋巴组织应是该病毒的主要靶组织，这些病毒抗原阳性组织多数伴随明显的组织损伤，其中以颌下淋巴结 （图1）和肺脏 （图2）的阳性染色最强，组织损伤也最严重。空白对照组仔猪被检组织IHC染色结果均为阴性。

3.3组织器官中PCV-2的含量

PCV-2 SD/2008株感染的仔猪，在接毒后各组猪的淋巴结 （颌下淋巴结、腹股沟浅淋巴结）、肝、脾、肺、肾、等免疫器官中PCV-2含量见表3。

检测结果发现：接毒后在仔猪的颌下淋巴结和肺脏中检测到大量的阳性细胞，PCV-2的含量高达31%和25%；在肾脏中PCV-2的含量较低，仅为4%，在一定程度上体现了PCV-2 SD/ 2008株在人工感染仔猪体内的分布的特性及感染特性，为进一步研究其致病性提供一定的依据。

4 讨论

4.1 石蜡切片中应注意的问题

取材时病料组织的大小要合适，一般为1 cm×1 cm×0.3 cm，便于固定剂迅速渗入内部；要求新剖杀且新鲜的组织；切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤而发生形态改变。

固定时为了使标本能反映它生前的正常状态，必须尽早地用某些化学药品迅速地杀死组织细胞，并将结构成分转化为不溶性物质，防止某些结构的溶化和消失。固定时，须注意以下几点：1）固定剂应有足够的量，一般为组织块体积的10～15倍；2）如所固定的材料外表有不易穿透的物质，可将材料先在含乙醇的溶液中固定几分钟，再移入水溶性的固定液；3）材料固定后如不立即下沉，可将其中气泡抽出；4）固定时间依材料大小、固定剂种类而异，可从1小时到几十小时，有时中间需要更新固定剂 （某些固定剂对组织的硬化作用较强），作用时间应严加控制，不能过长，一般情况不超过24小时；5）一般固定剂都以新配制的为好，用过的不能再用。有些混合固定剂由甲、乙两液合并者，一定要在使用前才混合；6）固定完毕，根据所用固定剂的不同，用水或乙醇冲掉残留的固定剂，一般可用纱布包裹，系于细流水下冲洗10～15小时，以免固定剂形成沉淀，影响以后组织块的染色；7）固定时间也因环境温度而异，随着温度的增高可缩短固定时间。

表2 PCV-2 SD/2008株在组织器官中的检出情况

表2 PCV-2 SD/2008株在组织器官中的检出情况

表3 免疫组化阳性率检测结果

表3 免疫组化阳性率检测结果

脱水时采用逐级提高酒精浓度（70%→80%→90%→95%→100%）进行样本脱水，逐级提高酒精浓度脱水法可以预防组织过度收缩、变脆以及脱水不完全，另外注意脱水时间。

透明时透明剂选取的是二甲苯，二甲苯作用较快，透明力强，但组织块在其中停留过久，容易收缩变脆变硬，同时若脱水不净，就会引起不良后果，在应用时必须特别小心。通常将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯。

透明时间应由组织大小而定，—般各级停留时间在30分钟至2小时，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过3小时为宜。材料经过透明，会显示出前一步脱水的效果如何，若脱水彻底，组织则显现透明状态，如组织中有白色云雾状，说明脱水不净，须返工处理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明时，应避免其挥发和吸收空气中的水分，并保持其无水状态。

浸蜡时浸蜡要充分，时间为2～3小时。浸蜡的目的是让石蜡替换组织中

脱水时采用逐级提高酒精浓度（70%→80%→90%→95%→100%）进行样本脱水，逐级提高酒精浓度脱水法可以预防组织过度收缩、变脆以及脱水不完全，另外注意脱水时间。

透明时透明剂选取的是二甲苯，二甲苯作用较快，透明力强，但组织块在其中停留过久，容易收缩变脆变硬，同时若脱水不净，就会引起不良后果，在应用时必须特别小心。通常将组织块先经纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯。

透明时间应由组织大小而定，—般各级停留时间在30分钟至2小时，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过3小时为宜。材料经过透明，会显示出前一步脱水的效果如何，若脱水彻底，组织则显现透明状态，如组织中有白色云雾状，说明脱水不净，须返工处理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明时，应避免其挥发和吸收空气中的水分，并保持其无水状态。

浸蜡时浸蜡要充分，时间为2～3小时。浸蜡的目的是让石蜡替换组织中的透明剂 （二甲苯），使石蜡填充整个组织块。此步骤是在温箱内进行，温度调至60℃左右，恰好使石蜡溶解。浸蜡的时间和温度是关键，浸蜡的温度过高或时间过长，会使组织块发生较大的收缩和脆变；如温度低了或时间短了，石蜡将得不到充分的饱和，组织块与石蜡结构不严，将会给制片带来许多困难。其中石蜡的质量也很重要，鉴别石蜡质量的方法是：将石蜡熔化后倒入纸盒使其凝结且无气泡和裂痕，30～35℃放置24小时且无气泡和不出现晶状小点，蜡块裂面不呈颗粒状，切成薄片不碎成细粒。含有杂质的新蜡或用过的废蜡可清洁后再用，方法是将石蜡放入锅内，加热到开始冒白烟，然后用小火继续加热30分钟 （注意别超过着火点），使其去除水分和挥发性杂质，并在温箱中过滤以去除杂质等颗粒。

包埋要快速认真。包埋是指将组织埋入石蜡，凝固成块。包埋之前应将包埋皿与包埋镊子一起放在温箱中加热。包埋时速度要快，防止包埋蜡与组织块的温度相差太大、蜡与组织块结合不紧密而导致切片困难。的透明剂 （二甲苯），使石蜡填充整个组织块。此步骤是在温箱内进行，温度调至60℃左右，恰好使石蜡溶解。浸蜡的时间和温度是关键，浸蜡的温度过高或时间过长，会使组织块发生较大的收缩和脆变；如温度低了或时间短了，石蜡将得不到充分的饱和，组织块与石蜡结构不严，将会给制片带来许多困难。其中石蜡的质量也很重要，鉴别石蜡质量的方法是：将石蜡熔化后倒入纸盒使其凝结且无气泡和裂痕，30～35℃放置24小时且无气泡和不出现晶状小点，蜡块裂面不呈颗粒状，切成薄片不碎成细粒。含有杂质的新蜡或用过的废蜡可清洁后再用，方法是将石蜡放入锅内，加热到开始冒白烟，然后用小火继续加热30分钟 （注意别超过着火点），使其去除水分和挥发性杂质，并在温箱中过滤以去除杂质等颗粒。

包埋要快速认真。包埋是指将组织埋入石蜡，凝固成块。包埋之前应将包埋皿与包埋镊子一起放在温箱中加热。包埋时速度要快，防止包埋蜡与组织块的温度相差太大、蜡与组织块结合不紧密而导致切片困难。

包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度，保证组织块与周围石蜡完全融为一体。石蜡的迅速冷却也很重要，否则包埋块中将会产生结晶，导致以后切片时引起碎裂。包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修，便于切片。

切片刀与切片的质量直接相关。切片前必须磨刀，刀片锋利对切片的完整很重要。切片完毕，应及时用氯仿将切片机擦净。

切好的切片必须贴附于载玻片上才能作进一步处理，但是切片常有细小的横纹，必须经展平后才能贴附，否则影响染色和观察。捞片时水浴温度要控制好，温度太高易导致组织片上的细胞组织间隙分散，温度太低展片不充分，组织片易皱折。

烤片的温度和时间很重要：温度太高，时间太长，会造成对组织的损伤；温度太低，时间不足，染色时易发生脱片或脱蜡不净，切片着色浅，不上色或灰染。

实验用的载玻片必须洁净，不能有油污 （检验法：已涂有粘片剂的载玻片上滴加数滴蒸馏水，若发现水不均匀分散而聚成滴状，即表示载玻片不清洁，有残留油脂等在上面）；切片的光面应朝下，否则染色过程中切片容易脱落。

4.2 免疫组化结果分析讨论

PCV-2引起PMWS临床症状和病变的严重程度与感染猪的年龄、感染病毒量及有无PCV-2抗体等因素有关。PCV-2能单独引发PMWS，但单纯用PCV-2很难复制出PMWS的典型临床症状，只产生非典型的、轻微的或中等程度的临床症状和病理损伤，如果要产生典型的PMWS症状必须与其它协同因子如PRRSV、PPV、PRV或猪肺炎支原体的共同感染才行。

本试验使用猪圆环病毒2型SD/ 2008株接种实验猪,复制出一些的PMWS临床症状，如腹股沟淋巴结肿大；颌下淋巴结肿大坏死；脾脏大头明

包埋用蜡的温度应略高于透蜡温度，保证组织块与周围石蜡完全融为一体。石蜡的迅速冷却也很重要，否则包埋块中将会产生结晶，导致以后切片时引起碎裂。包埋好的石蜡块装上切片机进行切片前还须进行固着和整修，便于切片。

切片刀与切片的质量直接相关。切片前必须磨刀，刀片锋利对切片的完整很重要。切片完毕，应及时用氯仿将切片机擦净。

切好的切片必须贴附于载玻片上才能作进一步处理，但是切片常有细小的横纹，必须经展平后才能贴附，否则影响染色和观察。捞片时水浴温度要控制好，温度太高易导致组织片上的细胞组织间隙分散，温度太低展片不充分，组织片易皱折。

烤片的温度和时间很重要：温度太高，时间太长，会造成对组织的损伤；温度太低，时间不足，染色时易发生脱片或脱蜡不净，切片着色浅，不上色或灰染。

实验用的载玻片必须洁净，不能有油污 （检验法：已涂有粘片剂的载玻片上滴加数滴蒸馏水，若发现水不均匀分散而聚成滴状，即表示载玻片不清洁，有残留油脂等在上面）；切片的光面应朝下，否则染色过程中切片容易脱落。

4.2 免疫组化结果分析讨论

PCV-2引起PMWS临床症状和病变的严重程度与感染猪的年龄、感染病毒量及有无PCV-2抗体等因素有关。PCV-2能单独引发PMWS，但单纯用PCV-2很难复制出PMWS的典型临床症状，只产生非典型的、轻微的或中等程度的临床症状和病理损伤，如果要产生典型的PMWS症状必须与其它协同因子如PRRSV、PPV、PRV或猪肺炎支原体的共同感染才行。

本试验使用猪圆环病毒2型SD/ 2008株接种实验猪,复制出一些的PMWS临床症状，如腹股沟淋巴结肿大；颌下淋巴结肿大坏死；脾脏大头明显肿大，小头呈锯齿状，大头脾门淋巴结梗死；肺脏严重肉变，整肺呈花斑样、淤血出血，右侧隔叶灰黄色病灶，左侧尖叶气肿；肝脏有不同程度的虎斑状病变；肾脏大部分呈黄色，皮质出现大量米粒大的坏死灶。表明猪圆环病毒2型SD/2008株病毒确能造成猪体组织感染并引起病变。

阳性结果应定位在细胞相应的部位，不当的抗原修复会导致抗原在组织细胞中定位的改变。根据所检测抗原的不同，抗原分别定位在不同部位。组织的周边、气泡、刀痕、皱折等部位往往呈现非特异性阳性反应，要注意区分与鉴别。染色结果呈阴性并非都是抗原不表达，要考虑是否与组织中的抗原受到破坏有关。

组织切片背景深与下列因素有关：石蜡切片脱蜡不干净；第一抗体浓度过高或孵育时间过长，温度过高；显色剂浓度过高；抗体不纯等。

由于抗体的品种繁多，实验方法多种多样，本实验室曾摸索过实验条件并予以运用。

本研究使用免疫组化法检测PCV-2病毒抗原，结果显示：在颌下淋巴结、肺脏中，显示强阳性信号；在肺泡、腹股沟淋巴结、肝脏中，显示弱阳性；在肾脏中，阳性信号不明显。对照组没有检测到阳性信号。

在各组织中，淋巴组织应是该病毒的主要靶组织，被病毒感染的细胞也较多。在其它检测到PCV-2病毒的组织中，感染细胞也基本为巨噬细胞和淋巴细胞。

综上所述，本研究使用猪圆环病毒2型 PCV-2 SD/2008株系统研究了PCV-2人工感染猪体内重要组织器官中病毒分布情况，为我国科研工作者研究PCV-2致病机理奠定了基础。