乳腺导管内增生性病变p53外显子突变的研究

毛晓韵，范垂锋，魏晶，刘崇，姚凡，金锋

（1.中国医科大学附属第一医院肿瘤外科，普通外科教研室，乳腺外科，沈阳 110001；2.中国医科大学基础医学院病理学教研室，沈阳110001）

乳腺导管内增生性病变p53外显子突变的研究

毛晓韵1，范垂锋2，魏晶1，刘崇1，姚凡1，金锋1

（1.中国医科大学附属第一医院肿瘤外科，普通外科教研室，乳腺外科，沈阳 110001；2.中国医科大学基础医学院病理学教研室，沈阳110001）

目的肿瘤抑制基因p53突变是浸润性乳腺癌发生发展中常见事件，而其与包括普通型增生（UDH），不典型增生（ADH）及导管内原位癌（DCIS）的乳腺导管内增生性病变关系不明。探讨p53在乳腺导管内增生性病变的外显子突变情况，以期了解p53突变在乳腺癌发生发展中的作用。方法 用高分辨率熔解曲线和测序研究122例乳腺导管内增生性病变中p53外显子5～8的突变情况。结果 经HRM筛选，14例患者DNA熔解曲线与野生型标准品熔解曲线大于阈值，经测序分析，其中13例出现p53外显子突变。35例UDH中均未发现突变，10.7%（6/56）ADH和22.6%（7/31）DCIS发现至少1个位点的点突变，其中1例DCIS发现2个位点的突变。结论p53突变发生于乳腺导管内增生性病变中的ADH与DCIS，其可能为乳腺癌发生发展中的早期事件。

乳腺导管内增生性病变；p53突变；高分辨率熔解；DNA测序

p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，突变型p53蛋白表达对乳腺癌的临床分期和预后产生负性影响［1］。乳腺导管内增生性病变是一组形态学结构复杂多样、与乳腺癌关系十分密切的病变［2］。其主要发生于终末导管小叶单位，少数发生于大导管和输乳管，包括普通型导管增生（usual ductal hyperplasia，UDH）、非典型导管增生（atypical ductal hyperplasia，ADH）和导管原位癌（ductal carcinoma in situ，DCIS），与发生浸润性乳腺癌的危险性相关［3］。目前，有关p53与乳腺导管内增生性病变，特别是与乳腺导管内非典型增生病变相关性的研究报道较少，其在中国人群突变情况未见报道。高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM）技术是近年来在传统突变检测方法的基础上发展起来的一种用于突变扫描和基因分型的新技术，其原理在于熔解曲线的变化取决于扩增产物的序列、长度和碱基组成，通过熔解曲线的变化反映核酸性质的差异，是应用熔解曲线对突变位点进行检测的新方法［4，5］。以前大量研究表明，95%的p53突变发生于高度保守的外显子5～8区域，且在所有p53突变形式中，常见的是因点突变引起的错义突变，而缺失或插入突变都是较少发生的［8］。在本研究中，我们通过HRM和基因测序研究p53外显子5～8在乳腺导管内增生性病变中的突变，以期了解其在乳腺癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集中国医科大学附属第一医院乳腺外科2007年6月至2009年10月女性新鲜不伴癌的乳腺导管内增生性病变标本122例（UDH35例，ADH 56例，DCIS 31例），年龄18～72岁，中位年龄37.6岁。患者术前均未经放化疗，其病理经2位病理医生按世界卫生组织（WHO）《乳腺病理组织学分类》（2003新版）标准读片确认其病理类型，-80℃保存。

1.2 DNA提取

每例均经冰冻切片HE染色，确认病理类型和定位，用酚氯仿法提取乳腺导管内增生性病变组织DNA，用NanoDrop 1000紫外分光光度计测定核酸质量及浓度，并全部标准化为10ng/μl。

1.3 HRM检测

p53基因第5、6、7和8外显子HRM PCR引物及产物长度见表1。20μl HRM PCR反应体系含10ng基因组 DNA，上下游引物各 20μmol，MgCl21.5mmol，2×Light Cycler誖 480High Resolution Master Mix（罗氏公司，德国）10μl，以野生型标准品为阳性对照。加样完成后，使用Roche专用贴膜将96孔PCR反应板封住，液体充分混匀后置Roche Lightcycler 480中检测。PCR循环条件为94℃变性15min，然后进入94℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸25s循环，循环45次，最后72℃延伸5min。HRM 过程：95℃ 1min，40℃ 1min，65℃ 1s，再以每秒1℃的速度从65℃升至95℃，Light Cycler誖480系统特有的基因扫描软件于升温过程中每度检测40次荧光，计算出熔解曲线图。

表1p 53外显子引物及P C R产物长度T a b.1p 53p r i me r s a n d P C Rp r o d u c t s i z e Exon Sequence（5'→3'） Size（bp）5 Fwd：TTCCTCTTCCTGCAGTACTC Rev：CAGCTGCTCACCATCGCTAT 6 Fwd：CACTGATTGCTCTTAGGTCT Rev：AGTTGCAAACCAGACCTCAG 7 Fwd：GTGTTATCTCCTAGGTTGGC Rev：CAAGTGGCTCCTGACCTGGA 8 Fwd：CCTATCCTGAGTAGTGGTAA Rev：TCCTGCTTGCTTACCTCGCT 210144144165

1.4 HRM产物的测序分析

用相应引物扩增、纯化和回收通过HRM筛出的突变样品，置ABI 3730测序仪测序（上海生工公司）。

2 结果

经HRM分析，共14例患者DNA熔解曲线与野生型标准品熔解曲线大于阈值，结合测序分析结果发现，其中13例出现p53外显子突变（图1，2，表2）。35例 UDH 中均未发现突变，10.7%（6/56）ADH和22.6%（7/31）DCIS发现至少1个位点的点突变，其中1例DCIS发现2个位点的突变。突变位点依据国际公共p53突变数据库（The universal mutation p53database，UMDp53database，http：//p53.free.fr/）查出其在人类肿瘤的突变频率。在所发现的14个p53突变位点中，有2例突变位于第五外显子，3例突变位于第6外显子，4例突变位于第7外显子，5例突变位于第8外显子。

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3 讨论

以往检测致病突变的主要方法有PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针、PCR-测序、PCR-单链构象多态性、PCR-限制性片段长度多态性等，以上方法不仅费用高，而且费时费力，无法开展致病基因的大规模突变筛查［6］。HRM利用PCR后扩增子的核苷酸序列和长度不同而引起的各碱基含量的差异，通过不同温度下实时检测升温过程的熔解曲线来反映DNA链中单个或多个位点的基因变化。可以说，核苷酸的排列和配对碱基不同是其熔解温度产生差异的根本原因。HRM通过这种实时检测技术，判断升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，进行p53突变的初筛。有研究用HRM及测序方法对比研究了47个样本中p53的突变情况，发现HRM的敏感性达到1.0，特异性达到0.83［7］，我们研究中发现HRM筛出14位点的p53突变，测序结果表明其中13个为错义突变，1个未出现突变，特异性高。且其不受碱基突变位点和种类的局限，其不仅能够对已知突变进行分析，对未知突变的筛查、扫描和短片段重复序列的分析也有理想的检测效果。其还能缩短操作时间，简化操作步骤，大大降低使用成本，并且实现真正的闭管操作，最大限度地避免交叉污染。

肿瘤抑制基因p53在细胞周期调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等过程中都起着重要的作用。p53基因突变是目前所知人体肿瘤最常见的基因改变，在许多肿瘤的发病过程中起重要作用，该基因突变对乳腺癌的临床分期和预后产生负性影响。乳腺导管内增生性病变主要发生于终末导管小叶单位，少数发生于大导管和输乳管，与发生浸润性乳腺癌的危险性相关。长期随访发现，UDH是正常人的1.5倍，ADH为4～5倍，DCIS为8～10倍。普通型导管增生是一种以成二级管腔和中央增生细胞呈水流样分布为特征的良性导管增生，WHO工作小组认为UDH不是一种有意义的乳腺癌危险因素。Allred等［9］认为UDH没有p53基因突变和p53蛋白表达，除非是出现在Li-Fraumeni患者的遗传性突变。我们研究发现10.7%的乳腺导管内增生性病变存在p53突变，在所研究的35例UDH中均未发现p53突变，这与Allred等［9］的观点吻合。近期一项比较基因组杂交研究提示，UDH中的一部分可以是ADH的前驱病变。ADH是一种以分布均匀的单形细胞增生为特征的肿瘤性导管内病变，进展为浸润性乳腺癌的危险性为中度。DCIS也是一种肿瘤性导管内病变，其特征为导管上皮细胞呈显著增生，伴轻微至明显的异型性，有发展为浸润性乳腺癌的倾向。目前关于在ADH病变中p53突变的观点有争议。Done等［10］用PCR-SSCP在21例乳腺增生性病变中均未发现p53突变，其中包括1例ADH，其认为p53突变出现于DCIS阶段。Keohavong等［11］检测了6例DCIS和10例ADH的p53突变，发现在其中3例DCIS和5例ADH中存在p53突变，认为p53突变不仅出现于DCIS，也出现于ADH等。我们发现10.7%（6/56）ADH和22.6%（7/31）DCIS至少存在 1个位点的点突变，其中1例DCIS发现2个位点的突变，提示p53突变参与了乳腺癌的发生发展，且其可能为恶性肿瘤转化的早期事件。我们在ADH和DCIS中发现的p53突变位点及点突变类型在UMDp53突变数据库中均能找到，且出现了突变频率很高的几处突变类型（R175H，A273C，R248Q），这些点突变与p53蛋白结构与功能改变密切相关。p53基因突变在乳腺癌发生发展中的作用及意义，还需要我们进一步扩大样本量，追踪随访来验证和完善。

［1］Rossner P Jr，Gammon MD，Zhang YJ，et al.Mutations in p53，p53protein overexpression and breast cancer survival［J］.J Cell Mol Med，2009，13（9B）：3847-3857.

［2］李兰，杨红鹰.乳腺导管内增生性病变的病理学特点及其与浸润性癌的关系［J］.诊断病理学杂志，2008，1（15）：68-72.

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［5］Rapado I，Grande S，Albizua E，et al.High resolution melting analysis for JAK2Exon 14and Exon 12mutations：a diagnostic tool for myeloproliferative neoplasms［J］.J Mol Diagn，2009，11（2）：155-161.

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［11］Keohavong P，Gao WM，Mady HH，et al.Analysis of p53mutations in cells taken from paraffin-embedded tissue sections of ductal carcinoma in situ and atypical ductal hyperplasia of the breast［J］.Can Lett，2004，212（1）：121-130.

（编辑裘孝琦，英文编辑郑华川）

Mutation ofp53Exon in Breast Intraductal Proliferative Lesions

MAO Xiao-yun1，FAN Chui-feng2，WEI Jing1，LIU Chong1，YAO Fan1，JIN Feng1
（1.Department of Surgical Oncology，Research Unit of General Surgery，Department of Breast Surgery，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Pathology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveAlthoughp53mutation is one of the most common alterations identified in invasive breast carcinomas，it is not clear whether its alteration frequently occurs in intraductal proliferative lesions including usual ductal hyperplasia（UDH），atypical ductal hyperplasia（ADH）and ductal carcinoma in situ（DCIS）.The aim of this study is to investigate thep53mutation in intraductal proliferative lesions，and clarify its significance in breast carcinogenesis.Methodsp53mutation was examined in 122cases of noninvasive breast lesions including UDH，ADH and DCIS by high-resolution melting（HRM），followed by DNA sequence.ResultsThe positive rates ofp53mutation were 0.0%，10.7%and 22.6%in UDH，ADH and DCIS，respectively.Conclusionp53mutation occurs in intraductal proliferative lesions including ADH and DCIS，and might be an early event in breast carcinogenesis.

intraductal proliferative lesions；p53mutation；high-resolution melting；DNA sequence analysis

R737．3

A

0258-4646（2011）01-0060-04

国家自然科学基金资助项目（30950009）

毛晓韵（1979-），女，住院医师，博士.

金锋，E-mail：jinfeng66cn@hotmail.com

2010-10-05