睡眠剥夺对大鼠学习记忆、海马IL-1β表达的影响及SB203580干预作用

赵雅宁，李建民，陈长香，李淑杏

（河北联合大学康复医学系，河北 唐山 063000）

睡眠剥夺对大鼠学习记忆、海马IL-1β表达的影响及SB203580干预作用

赵雅宁，李建民，陈长香，李淑杏

（河北联合大学康复医学系，河北 唐山 063000）

目的睡眠剥夺（SD）对大鼠学习记忆、海马IL-1β表达的影响及SB203580干预作用。方法 90只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分成对照组、模型组、SB203580干预组。改良多平台法建立SD模型。光镜观察海马区神经细胞形态变化，免疫组化法和Western blot法检测海马区IL-1β蛋白的表达，水迷宫法测试动物学习记忆功能。结果 与对照组比较，模型组中，随睡眠剥夺时间延长，SD大鼠海马神经元结构损伤明显，存活神经元密度降低、IL-1β阳性细胞数及表达增多，动物学习记忆能力减退；与模型组比较，SB203580组中脑组织形态损伤程度减轻、存活神经元密度增加、IL-1β表达回降，动物学习记忆功能得到改善。结论SD可增加海马IL-1β表达，引起动物认知功能障碍，SB203580可能通过降低海马IL-1β表达，改善SD大鼠学习记忆功能。

睡眠剥夺；白细胞介素1；学习记忆

睡眠剥夺（sleep deprivation，SD）是指由于各种原因引起的睡眠丢失状态。随着生活节奏的加快，社会压力的增大等，睡眠剥夺已成为现代社会的普遍现象，是睡眠医学所关注的主要研究内容之一。来自临床的资料显示，睡眠剥夺可导致学习记忆能力下降、注意力分散、定向障碍等认知功能改变［1］。细胞因子白细胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）是中枢神经和免疫系统相互作用的关键信使之一，其不仅调节中枢神经系统的诸多生理活动，并广泛参与中枢神经系统疾病如Alzheimer's病（AD）、脑卒中的病理生理过程［2］。但IL-1β与SD导致的学习记忆障碍是否有关尚不清楚。本实验通过观察不同睡眠剥夺时间对大鼠海马IL-1β表达的影响，探讨IL-1β在睡眠剥夺（SD）大鼠认知障碍中的作用；同时本研究引入p38MAPK信号抑制剂SB203580，对SD后IL-1β表达的信号做初步的探讨。

1 材料与方法

1.1 动物分组和模型制备

雄性SD大鼠90只（北京维通利华公司，合格证：SCXK（京）2002-003），体质量（330±20）g，随机分为对照组（30只）、模型组（30只）和SB203580干预组（30只），每组平均分为SD1d、3d、5d 3个亚组。

采用改良多平台法制备异相睡眠剥夺模型。睡眠剥夺箱大小为30cm×30cm×150cm，中央放置一直径为6cm，高8cm的平台。剥夺箱内注有水，水面低于平台2cm水温保持在（20±2）℃。大鼠可在平台上进入睡眠时，由于骨骼肌的松弛使大鼠掉入水中而惊醒，造成睡眠剥夺。对照组除平台增大为直径13cm，其余因素与SD组一致，大鼠在大平台上进入睡眠。SB203580干预组的实验条件，造模前30min经尾静脉静脉注射，剂量0.5μg/kg，以后，每隔24h注射一次，连续给药5d。

1.2 脑组织形态结构观察（HE染色）

各组动物在规定时间点0.4%戊巴比妥纳麻醉动物，开胸、暴露心脏，4%多聚甲醛行心脏灌流，断头取脑，在视交叉处冠状面切开，取中间块入4%多聚甲醛固定液固定，石蜡包埋，切片（片厚5μm），进行HE染色。每只鼠连续3张冠状背侧海马切片，采用图像分析仪（美国Bio-Rad公司）计数正常神经元，取均值。

1.3 IL-1β免疫组化

切片常规脱蜡至水，参照试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）说明进行免疫组化染色。阳性率的定量分析：每个标本取4张切片，400倍光镜下每张切片在海马随机选取4个视野，用计算机图像分析系统（Bio-Rad）对各组阳性细胞进行吸光度（absorbance，A）分析。

1.4 免疫印迹法测定海马区IL-1β

脱颈法处死大鼠，断头取脑，分离海马，加入裂解液，冰浴中匀浆，4℃离心 5min，3000r/min，取上清，考马斯亮蓝法蛋白质定量，样品制备，转膜、加入抗体（IL-1β，1∶1500；β-actin，1∶1000）、封闭、ECL 显色。Bio-Rad系统进行吸光度测定，以目的条带与内参照β-actin的平均吸光度的比值表示蛋白水平，进行半定量分析。

1.5 学习和记忆功能检测

按照Smith等［3］的方法，采用Morris水迷宫进行检测，上午、下午各一次，记录各组大鼠搜索安全岛（即平台）潜伏期时间（单位时间：s）；和撤去平台后动物穿越原平台位置的次数，取检测记录的总均值。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 病理结果

对照组海马神经细胞形态结构正常，排列整齐致密；模型组中，SD 1d海马神经元出现形态结构改变，表现为细胞水肿，随时间延长至3d、5d，细胞结构损伤时，视野内可见坏死改变的神经细胞，表现为细胞周围空隙增宽、胞核皱缩浓染等，存活神经元密度明显减少（P<0.05）；SB203580干预组存活神经元密度均增加（P<0.05）。（表 1、图 1）。

表1各组海马区的神经元密度比较（n=15，±s）T a b.1C o mp a r i s o n o f n e u r o n d e n s i t y i n h i p p o c a mp a l r e g i o n（n=15，±s）Group 1d 3d 5d Control group 26.33±4.27 26.53±4.56 25.93±4.17Model group 20.15±3.901） 18.85±3.781） 13.52±2.681）SB203580group 23.93±3.572） 22.86±3.572） 23.03±3.882）1）compared with control group，P ＜ 0.05；2）compared with model group，P ＜ 0.05.

2.2 IL-1β免疫组化和免疫印迹结果

免疫组化结果显示IL-1β阳性表达主要位于细胞浆。阳性细胞的胞质可见细小的棕黄色颗粒。对照组大鼠海马区只有极少量的阳性细胞，染色较淡。SD后1d、3d、5d IL-1β阳性细胞呈不同程度增加，染色棕黄，阳性细胞主要分布在海马易敏感区CA1区、其次在CA2、CA3区，齿状回也有少量有分布；SB203580组中IL-1β阳性细胞减少，染色变淡。免疫印迹定量结果显示，与对照组比较，模型组中IL-1β蛋白水平在相应时间点明显上调，SD5d达高峰（P<0.05）；SB20358干预组中IL-1β蛋白水平下降（P<0.05）。（表 2、图 2）。

表2各组I L-1β蛋白表达水平比较（±s）T a b.2C o mp a r i s o n o f I L-1β e x p r e s s i o n i n e a c h g r o u p（±s）Group 1d 3d 5d Control group 0.40±0.17 0.52±0.15 0.48±0.12Model group 3.56±1.191） 4.60±1.291） 7.68±2.561）SB203580group 1.58±0.472） 1.88±0.492） 4.45±1.232）1）compared with control group，P ＜ 0.05；2）compared with model group，P ＜ 0.05.表3各组大鼠水迷宫检测结果（±s）T a b.3Mo r r i s w a t e r ma z e i n e a c h g r o u p（±s）Groups Latency to find the platform Time of passing the platform 1d 3d 5d 1d 3d 5d Control group 55.5±7.5 54.7±6.3 55.8±6.5 8.20±1.52 8.25±1.62 8.31±1.58Model group 92.5±21.81） 105.6±24.51） 120.8±28.01） 5.08±1.111） 4.25±1.221） 2.28±1.001）SB203580group 62.0±16.72） 70.5±20.72） 84.8±22.82） 6.98±1.322） 5.68±1.122） 4.17±1.152）1）compared with control group，P ＜ 0.05；2）compared with model group，P ＜ 0.05.

2.3 学习记忆功能结果

与对照组比较，模型组大鼠搜索安全岛潜伏期明显延长、穿越原平台位置的次数减少（P＜0.05）；SB20358干预可缩短大鼠搜索安全岛潜伏期时间、增多穿越原平台位置的次数（P＜0.05，表3）。

3 讨论

睡眠是人类日常生活中的必要组成部分，不仅涉及体温调节、免疫功能的维持等，亦能促进记忆的巩固，使其转化成更加稳定的状态。有数据显示，剥夺睡眠超过24h，可导致人认知能力下降30%～70%［1］。近年来，国内外学者开展了睡眠剥夺对认知功能的影响，但相关机制尚需深入研究。

中枢神经系统IL-1β生物功能与其浓度有关。生理情况下，IL-1参与中枢神经系统的免疫调节、促进神经元的生长发育以及记忆等。而当脑受到缺氧、缺血刺激时，IL-1β异常升高，高浓度IL-1β可抑制海马部位神经元的兴奋性和突触功能从而导致认知功能障碍［4］。MaAfoose等［5］认为高浓度 IL-1β 可直接影响长时程增强（LTP）或神经的发生引起学习记忆缺陷。本研究观察与认知功能密切区域-海马区IL-1β表达，结果发现随睡眠剥夺时间延长，模型组中海马区IL-1β较对照组表达明显增高；结果还显示随睡眠剥夺时间延长，模型组中动物搜索安全岛潜伏期与穿越原平台位置的次数较对照组差异显著，说明睡眠剥夺能使IL-1β表达增多。推测睡眠剥夺后，脑组织氧化应激反应增强，相对敏感性较强的海马区IL-1β表达增高，从而引起动物学习和记忆功能受损。

实验证实，IL-1β主要通过p38有丝分裂原活化 蛋 白 激 酶 （mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信号途径参与多种疾病如脑卒中、AD病等病理过程［6，7］。即 p38MAPK 活性越强，IL-1β 表达越高，同时高浓度的IL-1β可进一步增加p38MAPK信号活性。研究显示P38MAMPK对脑损伤后的神经功能起负性调节作用［8，9］。本研究，应用 p38MAPK 蛋白特异性抑制剂SB203580进行干预，初步探讨p38MAPK与睡眠剥夺认知功能、IL-1β之间的关系。结果显示：与模型组比较，SB203580干预组中动物学习记忆功能得到改善、海马区神经元存活密度增加、IL-1β表达，提示p38MAPK信号途径和IL-1β可能是睡眠剥夺认知功能障碍重要机制之一，睡眠剥夺可能通过影响p38MAPK/IL-1β信号转导途径，进而损害机体的学习记忆功能；而SB203580通过抑制SD后p38MAPK信号通路活化级联反应，下调IL-1β表达，最终促进了学习记忆功能的恢复。有关SD后p38MAPK信号活化的具体机制尚需深入研究。

［1］Buguet A，Moroz D.Modafinil-medical considerati on for use in sustained operations［J］.Aviat Space Environ Med，2003，74（6）：659-663.

［2］李浩，吴敏，姚明江，等.老年轻度认知功能障碍与氧自由基代谢、乙酰胆碱酯酶、血脂及炎性介质的关系［J］.临床神经病学杂志，2008，21（3）：201-204.

［3］Smith DH，Okiyama K，Thomas MJ，et al.Evaluation of memory dysfunction following experimental brain injury using the Morris water maze［J］.Neurotrauma，1991，8（4）：259-269.

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［5］McAfoose J，Bauner BT.Evidence for a cytokine model of cognitive function［J］.Neurosci Biobehav Rev，2009，33（3）：355-366.

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（编辑孙宪民，英文编辑郑华川）

Effect of Sleep Deprivation on Learning-memory and Hippocampal IL-1β in Rats and the Role of SB203580Intervention

ZHAO Ya-ning，LI Jian-min，CHEN Chang-xiang，LI Shu-xing
（Department of Rehabilitation Medicine for Hebei United university，Tangshan 063000，China）

ObjectiveTo investigate the effects of sleep deprivation （SD）on learning-memory and hippocampal IL-1β in Rats and the role of SB203580intervention.MethodsMale Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups：control，model，SB203580-treated groups.SD models were established by the modified multiple platform methods.Morphological changes were observed with light microscopy.The IL-1β expression was examined by immunohistochemistry and Western blot.Learning and memory function was monitored with Morris water maze.ResultsCompared with control group，neuronal structure was obviously damaged，the density of survival neurons decreased，the IL-1β expression increased and learning and memory function significantly decreased with time of SD in model group.Compared with model group，the density of survival neurons was increased，IL-1β expression obviously decreased，but the ability of learning and memory function enhanced in SB203580-treated group（P ＜ 0.05）.Conclusions SD could increase IL-1β expression and finally result in cognition injury.However，SB203580improved learning-memory function by attenuating IL-1β expression.

sleep deprivation；interleukin-1β；learning-memory

R338.6

A

0258-4646（2011）01-0030-04

河北省科技厅支撑项目（2009276103D-7）

赵雅宁（1974-），女，副教授，硕士.

李建民，E-mail：lijianmints@sina.com

2010-09-09