鼠IL-2基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

黄大林，袁桂峰，王 鑫，李彬彬，钟 江*

(1桂林医学院，广西桂林541004;2复旦大学)

杆状病毒是一类双链DNA大型病毒，能够感染600多种昆虫，可在感染的昆虫细胞中形成特征性的病毒包涵体。苜蓿银纹夜蛾多角体病毒(AcMNPV)是昆虫杆状病毒科核多角体病毒属的模式种，也是研究最多的杆状病毒。杆状病毒由于其自身的独特性使它成为一种新型的哺乳动物细胞基因表达和基因治疗的载体［1］。上世纪80年代建立的杆状病毒—昆虫细胞表达系统已经成为一种最常用的真核细胞表达系统。但是感染病毒作为哺乳动物细胞基因转移载体也有一些缺点:在体内会引起补体反应;带入的表达框在哺乳动物细胞中可能被沉默;对不同细胞的基因转移效率有很大差别。2009年11月～2010年6月，我们使用Bac-to-Bac系统成功构建鼠IL-2基因杆状病毒表达载体。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 采用SPF级40日龄的昆明小鼠进行试验，体质量(22.08±3.00)g。采用拉颈法处死小鼠，无菌打开腹腔取出小鼠脾脏，使用100目细胞筛网制备脾细胞悬液，采用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞。

1.2 菌种和质粒 大肠杆菌JF1125;昆虫细胞草地夜蛾卵巢组织细胞系Sf9;苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)、质粒pFastBacDual及T-CMVp等由复旦大学微生物学与微生物工程系钟江课题组实验室保存。

1.3 试剂 限制性内切酶、T4 DNA连接酶和碱性

磷酸酶购自TaKaRa大连宝生物工程公司;TNM-FH培养液由购自Sigma公司的粉剂配制，加10%的小牛血清使用。转染试剂CellFectin购自Invitrogen公司;DNA凝胶回收试剂盒以及PCR产物回收试剂盒购自上海杰瑞生物科技有限公司;细胞总RNA抽提试剂盒和反转录试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。DNA标准分子量:λDNA/EcoRⅠ+ HindⅢ购自 MBI Fermentas公司;DL2000购自物TaKaRa公司;RNase A购自上海华舜生物工程有限公司;Taq DNA polymerase购自北京天根公司，蛋白酶K购自Roche公司。

1.4 方法

1.4.1 小鼠IL-2基因的获得及鉴定 将鼠脾淋巴细胞在刀豆球蛋白A(Con A)的刺激下体外培养27 h后，提取激活淋巴细胞总RNA;参照GenBank发表的鼠IL-2 cDNA基因序列设计一对引物，逆转录得到cDNA，以此为模板进行PCR扩增。设计引物IL-2 F:5'-ATATCTAGAATACAGCAGCATGCAGCTCGC-3'，R:5'-TCTGCTACCTTAGTCGTCGTGGTCTTTGTAGTCTTGAGGGCTTGTTGAGATG-3'，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。反应条件:94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环，最后72℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定。

1.4.2 重组含有小鼠IL-2基因质粒载体 用XbaⅠ/KpnⅠ双酶分别切pFastBac质粒和IL-2的PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳割胶回收DNA，分别作为载体和供体片段，通过T4连接酶连接得到pFBIL2，经过转化大肠杆菌JF1125得到pFB-IL2质粒，提取质粒进行酶切和PCR鉴定。

1.4.3 载体加入真核细胞启动子CMV 用EcoRⅠ酶切pFB-IL2(需CIAP去磷酸化处理)和T-CMVp上切下CMV启动子片段，分别作为载体和供体片段，通过T4连接酶在16℃连接12 h，CMV启动子插入pFB-IL2的EcoRⅠ位点，经过转化大肠杆菌JF1125得到pFB-CMV-IL2质粒，提取质粒DNA。

1.4.4 重组小鼠IL-2基因质粒载体的酶切鉴定和序列分析验证 pFB-CMV-IL2质粒用KpnⅠ、XbaⅠ和BgⅡ分别进行酶切鉴定，结果正确后并将构建的pFB-CMV-IL2质粒转化JF1125，将菌液进行质粒序列分析测定。

1.4.5 重组Bacmid-pFB-CMV-IL2质粒转染Sf9细胞 利用Invitrogen公司的产品Bac-to-Bac系统来构建重组杆状病毒，挑取转化DH10Bac感受态细胞生长的白色菌落，提取Bacmid，脂质体转染法将

Bacmid-pFB-CMV-IL2转染 Sf9细胞包装病毒，Sf9细胞培养于Sf 900Ⅱ培养液中培养3 d，收获上清获取完整重组杆状病毒，反复感染Sf9细胞扩增病毒。提取病毒基因组，抽病毒基因组的步骤为:①500 μl病毒液中加入500 μl 20%的PEG8000和1.6 mmol/ L NaCl的混合液，室温放置30 min，12 000 r/min离心15 min。②弃上清，沉淀加入20 μl水，80 μl裂解液和5 μl蛋白酶并混匀，50℃保温1 h。③用苯酚—氯仿—异戊醇抽提直至上下两相分明，两相间无明显杂质。④加入两倍体积的无水乙醇，－20℃放置10 min，离心10 min，弃上清后烘干沉淀，加入16 μl无菌水－20℃保存备用。用PCR验证重组杆状病毒的正确性。

2 结果

2.1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果 扩增产物片段大小为500 bp，与阳性对照IL-2吻合，表明已经成功扩出IL-2目的片段。

2.2 PCR技术鉴定pFB-IL-2质粒结果 表明目的片段IL-2已经成功重组入载体中，见图1。

图1 PCR检测PFB-IL-2质粒

2.3 酶切pFB-CMV-IL2质粒结果 用KpnⅠ酶切PFB-CMV-IL-2分别得到0.5 kb、0.7 kb和4.7 kb 3个片段;用XbaⅠ酶切得到0.7 kb和5.2 kb 2个片段;用BglⅡ酶切得到0.5 kb、1.8 kb和3.6 kb 3个片段，与预期结果吻合，表明成功重组构建PFBCMV-IL-2载体。

2.4 菌液测序结果 利用Blast软件在GenBank进行序列比对，菌液测序结果与GenBank鼠IL-2相吻合，成功构建含鼠IL-2的载体质粒，验证实验结果正确。

2.5 重组杆状病毒穿梭载体的PCR验证 提取病毒DNA基因组，用IL-2特异性引物进行PCR扩增，成功扩出了一条约500 bp的条带，与预期结果相符，证明重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-IL-2重组成功。见图2。

图2 PCR鉴定重组杆状病毒基因组

3 讨论

杆状病毒载体重组杆状病毒构建方便，易于扩大培养规模及获得高滴度的病毒，杆状病毒的基因组和棒状的核衣壳可以容纳100 kb的DNA，最大可插入约40 kb的外源基因;能转染末端分化细胞和原代培养细胞;当以高感染复数感染哺乳动物细胞，没有细胞毒性，安全性好，在哺乳动物细胞内不会整合到基因组中，不能自行复制，自身启动子在哺乳动物细胞内也没有活性［2］。Bac-to-Bac系统将杆状病毒—昆虫细胞表达系统变为了一个具有广泛应用前景的系统，这个系统将外源基因通过定向重组克隆到杆状病毒基因组上多角体启动子后，成功构建杆状病毒的穿梭质粒，整个重组过程都在大肠杆菌中完成，重组子可以通过抗生素和lacZ标记方便挑选。只要将大肠杆菌中的穿梭质粒即病毒基因组提取出来，转染昆虫细胞就可以得到重组病毒。随着杆状病毒—昆虫表达系统的应用范围越来越广，现在已经发展出一系列用于定向转座的供体质粒，甚至能利用杆状病毒在昆虫细胞中同时表达多个蛋白。由于有高效表达启动子(多角体启动子和p10启动子)，表达外源蛋白效率高［3］;可对表达的蛋白进行糖基化修饰;容易扩大规模达到生产要求。迄今已经通过杆状病毒—昆虫细胞表达系统成功表达了许多外源基因，例如鸡胃酶解肌球蛋白、视紫质激酶、人类β-干扰素等。

IL-2主要是由激活T淋巴细胞产生的一类Th1型细胞因子，在抗肿瘤、抗毒素、免疫调节及治疗感染性疾病中具有重要作用，具有十分重要的免疫生理调节效应［4，5］。自 Taniguchi等［6］从人体细胞中首次克隆出IL-2全长cDNA并报道其全序列以来，已从30多种动物中克隆出此基因，重组IL-2也在提高机体免疫力、抗感染和治疗癌症等方面获得了广泛的应用［7］。

本试验首先通过RT-PCR扩增出IL-2基因，通过构建鼠 IL-2的转移质粒，通过克隆将其插入pFastBacDual，成功构建了杆状病毒表达系统的转移载体pFB-CMV-IL2质粒，通过转染Sf9昆虫细胞，成功获得含IL-2的重组杆状病毒，为进一步研究该蛋白的最佳表达、生物学活性、动物实验等奠定了良好的基础，同时亦为其他蛋白质的真核表达提供了方法学的参考。

［1］Kost TA，Condreay JP.Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene delivery vectors［J］.Trends biotechnol，2002，20(4): 173-180.

［2］Hüser A，Hofmann C.Baculovirus vectors:novel mammalian cell gene-delivery vehicles and their applications［J］.Am J Pharmacogenomics，2003，3(1):53-63.

［3］Maeda S.Expression of foreign genes in insects using baculovirus vector［J］.Annu Rev Entomol，1989，34:351-372.

［4］Allen EM，Weir JP，Martin S，et al.Role of coexpression of IL-2 and herpes simplex virus proteins in recombinant vaccini a virus vectors on levels of induced immunity［J］.Virol Immunol，1990，3 (3):207-215.

［5］Kogut M，Roothwell L，Kacser P.Differential effect of age on chicken heterophil futional activation by recombinant chicken interleukin-2［J］.Dev Comp Immunol，2002，26(9):817-830.

［6］Taniguchi T，Matsui H，Fujita T，et al.Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2［J］.Nature，1983，302 (5906):302-305.

［7］Zelus D，Robinson-Rechavi M，Delacre M，et al.Fast evolution of interleukin-2 in mammals and positive selection in ruminants［J］.J Mol Evol，2000，51(3):234-244.